एन के क्रिस्टल संरचना-टर्मिनल डोमेन के Ryanodine रिसेप्टर से Plutella xylostella
Summary
इस आलेख में, हम प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण और diamondback मोठ (Plutella xylostella) से ryanodine रिसेप्टर के एन-टर्मिनल डोमेन की संरचना निर्धारण के प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
कीट ryanodine रिसेप्टर्स लक्ष्यीकरण (RyRs) शक्तिशाली और कुशल कीटनाशकों का विकास कृषि कीट नियंत्रण के क्षेत्र में बहुत रुचि की गई है । तारीख करने के लिए, कई diamide कीट RyRs लक्ष्यीकरण कीटनाशकों वाणिज्यिक किया गया है, जो २,०००,०००,००० अमेरिकी डॉलर के वार्षिक राजस्व उत्पंन । लेकिन RyR की कार्रवाई के मोड की समझ-लक्ष्यीकरण कीटनाशकों कीट RyR के बारे में संरचनात्मक जानकारी की कमी से सीमित है । इस बदले में कीट में कीटनाशक प्रतिरोध के विकास की समझ को प्रतिबंधित करता है । diamondback कीट (DBM) एक विनाशकारी कीट है जो दुनियाभर में cruciferous फसलों को नष्ट कर रहा है, जिसे diamide कीटनाशकों के प्रतिरोध को दिखाने के लिए भी सूचित किया गया है । इसलिए, यह महान व्यावहारिक महत्व का है उपंयास DBM RyR लक्ष्यीकरण कीटनाशकों का विकास, विशेष रूप से एक पारंपरिक diamide बंधन साइट से अलग क्षेत्र लक्ष्यीकरण । यहाँ, हम DBM से RyR के एन-टर्मिनल डोमेन को संरचनात्मक रूप से चिह्नित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. एक्स-रे क्रिस्टल संरचना २.८४ Å, जो एक बीटा-trefoil तह आकृति और एक पार्श्व अल्फा कुण्डली से पता चलता है की एक संकल्प पर आणविक प्रतिस्थापन द्वारा हल किया गया था । इस प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति, शुद्धि और अंय डोमेन या सामांय में प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
Ryanodine रिसेप्टर्स (RyRs) विशिष्ट आयन चैनल हैं, जो मांसपेशी कोशिकाओं में sarcoplasmic जालिका (एसआर) झिल्ली भर में सीए2 + आयनों के permeation मध्यस्थता. इसलिए, वे उत्तेजना संकुचन युग्मन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । अपने कार्यात्मक रूप में, RyR > 2 एमडीए के एक आणविक जन के साथ एक होमो-tetramer के रूप में इक्ट्ठा, प्रत्येक उपइकाई के साथ ~ ५००० एमिनो एसिड अवशेषों के शामिल । स्तनधारियों में, तीन isoforms हैं: RyR1-कंकाल की मांसपेशी प्रकार, RyR2-कार्डियक मांसपेशी प्रकार और RyR3-बैरे विभिन्न ऊतकों में व्यक्त1.
कीड़ों में RyR का केवल एक प्रकार है, जो मांसपेशियों और तंत्रिका ऊतक2में व्यक्त किया जाता है । कीट RyR के बारे में ४७%3की एक अनुक्रम पहचान के साथ स्तनधारी RyR2 के लिए और अधिक समान है । Lepidoptera और Coleoptera की RyR लक्ष्यीकरण Diamide कीटनाशकों को विकसित और बायर (flubendiamide), ड्यूपॉंट (chlorantraniliprole) और Syngenta (cyantraniliprole) जैसी प्रमुख कंपनियों द्वारा विपणन किया गया है । अपनी अपेक्षाकृत हाल ही में प्रक्षेपण के बाद से, diamide कीटनाशक कीटनाशकों के सबसे तेजी से बढ़ते वर्ग में से एक बन गए हैं । वर्तमान में, इन तीन कीटनाशकों की बिक्री सालाना २००९ (Agranova) के बाद से ५०% से अधिक की वृद्धि दर के साथ २,०००,०००,००० अमेरिकी डॉलर को पार कर गया है ।
हाल के अध्ययनों से इन कीटनाशकों के उपयोग की कुछ पीढ़ियों के बाद कीड़ों में प्रतिरोध के विकास की सूचना दी है4,5,6,7,8। diamondback कीट (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) और टमाटर लीफ़माइनर, तूता एब्सोल्युटा (G4903E, I4746M) में इसी स्थिति से RyRs के transmembrane डोमेन में प्रतिरोध उत्परिवर्तनों बताते है कि इस क्षेत्र diamide कीटनाशक बाध्यकारी में शामिल किया जा सकता है के रूप में इस क्षेत्र के चैनल4,8,9के गेटिंग के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है । इस क्षेत्र में व्यापक अनुसंधान के बावजूद diamide कीटनाशकों के सटीक आणविक तंत्र मायावी बने रहते हैं. इसके अलावा, यह स्पष्ट नहीं है कि प्रतिरोध उत्परिवर्तनों diamides सीधे या allosterically के साथ बातचीत को प्रभावित करता है ।
इससे पहले के अध्ययनों ने स्तनधारी प्रजातियों से कई RyR डोमेन की संरचना और पूर्ण लंबाई की संरचना स्तनधारी RyR1 और RyR2 द्वारा एक्स-रे क्रि और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, क्रमशः10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . लेकिन अभी तक, कीट RyR की कोई संरचना की सूचना दी है, जो हमें रिसेप्टर समारोह की आणविक जटिलताओं को समझने के साथ ही कीटनाशक कार्रवाई और कीटनाशक प्रतिरोध के विकास के आणविक तंत्र को प्रतिबंधित करता है ।
इस पांडुलिपि में, हम diamondback कीट, एक विनाशकारी cruciferous फसलों दुनिया भर में22से संक्रमित कीट से ryanodine रिसेप्टर के एन टर्मिनल β-trefoil डोमेन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । निर्माण प्रकाशित खरगोश RyR1 NTD क्रिस्टल संरचनाओं23,24और क्रायो-EM संरचनात्मक मॉडल के अनुसार डिजाइन किया गया था16,17,18,19, 20 , 21. यह पहली उच्च संकल्प संरचना कीट RyR, जो चैनल गेटिंग के लिए तंत्र का पता चलता है और प्रजातियों के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण टेंपलेट-संरचना आधारित दवा डिजाइन का उपयोग विशेष कीटनाशकों के लिए रिपोर्ट प्रदान करता है । संरचना elucidation के लिए, हम एक्स-रे क्रि, जो निकट परमाणु संकल्प पर प्रोटीन संरचना दृढ़ संकल्प के लिए ‘ सोने के मानक ‘ के रूप में माना जाता है कार्यरत हैं । हालांकि सघन प्रक्रिया अप्रत्याशित और गहन श्रम है, यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को व्यक्त करने में मदद करेगा, शुद्ध और कीट RyR या सामांय में किसी भी अंय प्रोटीन के अंय डोमेन की विशेषता ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में, हम इस प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए recombinantly एक्सप्रेस, शुद्ध, सघन और DBM RyR NTD की संरचना का निर्धारण । क्रिस्टलीकरण के लिए, एक महत्वपूर्ण आवश्यकता के लिए उच्च घुलनशीलता, पवित्रता और एकरूपता के साथ ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अनुसंधान के लिए धन द्वारा प्रदान की गई थी: चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (३१३२०१०३९२२, ३१२३००६१), और नेशनल बेसिक रिसर्च (९७३) कार्यक्रम की परियोजना चीन (2015CB856500, 2015CB856504) । हम शंघाई सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (SSRF) में beamline BL17U1 पर कर्मचारियों के लिए आभारी हैं ।
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
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