コナガからのリアノジン受容体の N 末端ドメインの結晶構造
Summary
この記事で私たちはコナガ (コナガ) からリアノジン受容体の N 末端ドメインの蛋白質の発現、精製、結晶化、構造決定のプロトコルを説明します。
Abstract
強力かつ効率的な農薬の昆虫リアノジン受容体 (RyRs) をターゲットとして開発されている農業害虫コントロールの領域に大きな関心。日付、著者殺虫 RyRs が製品化されている害虫を対象、20 億ドルの年間売り上げ高を生成します。RyR を対象とした殺虫剤の作用のモードの理解は昆虫 RyR に関する構造情報の不足によって制限されます。これは順番の害虫に殺虫剤抵抗性の発達の理解を制限します。コナガ (DBM) は、著者の殺虫剤に抵抗性を示すことも報告されている世界、アブラナ科作物を破壊する壊滅的な害虫です。したがって、それは DBM RyR、特に伝統的な著者の結合部位とは異なる地域をターゲットをターゲット新しい殺虫剤を開発する非常に実用的な重要なのです。構造的に特徴付ける DBM から RyR の N 末端ドメイン プロトコルを紹介します。X 線結晶構造の解像度で分子の交換によって解決された Å、2.84 のベータ トレフォイル折りたたみモチーフと並ぶ α ヘリックスを示しています。このプロトコルは一般的に式、浄化および他のドメインまたは蛋白質の構造解析の合わせることができます。
Introduction
リアノジン受容体 (RyRs) は、特定のイオン チャンネルは、筋細胞の筋小胞体 (SR) 膜を渡る Ca2 +イオンの透過を仲介します。したがって、彼らはプロセスを結合励起収縮に重要な役割を果たします。その機能の形で RyR 分子質量とホモ四量体としてアセンブル > 2 MDa、各サブユニットから成る 〜 5000 アミノ酸残基と。哺乳類では、3 つのアイソ フォーム: RyR1 – 骨格筋型、RyR2-心筋型および RyR3-普遍的組織1で表されます。
昆虫は、筋肉や神経組織2で表現される RyR の 1 種類のみです。昆虫 RyR は約 47% のシーケンス id を持つ哺乳類 RyR2 に似て3。RyR 鱗翅目や鞘翅目のターゲット著者殺虫剤を開発し、バイエル (フルベンジアミド)、デュポン (chlorantraniliprole)、シンジェンタ (cyantraniliprole) のような主要な企業によって販売されています。比較的最近の発売以来、著者殺虫剤は殺虫剤の急成長しているクラスの一つなっています。現在、これらの 3 つの殺虫剤は年間の売り上げ高は、2009 年 (Agranova) 以来 50% 以上の成長率で 20 億米ドルを越えています。
最近の研究では、これら殺虫剤4,5,6,7,8の使用法の数世代後の昆虫の抵抗の開発を報告しています。抵抗膜貫通ドメインの変異 RyRs コナガ (DBM)、コナガ(G4946E、I4790M) およびトマト マメハモグリバエに対応する位置から、このトゥタ(G4903E、I4746M) 領域を表示します。この地域はチャネル4,8,9のゲートのために重要であること知られている著者の殺虫剤の結合に関与するかもしれない。この分野で広範な研究にもかかわらず著者殺虫剤の正確な分子メカニズムはとらえどころのないままです。また、耐性変異がジアミドとの相互作用に影響するかどうか、直接またはアロステリックはクリアです。
以前の研究は、哺乳類からいくつかの RyR ドメインの構造と x 線結晶構造解析と電子顕微鏡で、それぞれ10、11、フルレングスの哺乳類 RyR1 と RyR2 の構造を報告しています。 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21.しかし、これまでのところ、昆虫 RyR の構造が報告されていない、受容体機能の分子の複雑さと同様、殺虫剤作用分子機序と殺虫剤抵抗性の発達を理解することから私たちを禁止します。
本稿では、コナガ、アブラナ科作物の世界22に感染する破壊的な害虫からリアノジン受容体の N 末端 β トレフォイル ドメインの構造特性の一般化されたプロトコルを提案する.公開されたウサギ RyR1 NTD 結晶構造23,24と低温電子顕微鏡構造モデル16,17,18,19,によると設計された構造20,21。 これは最初の高分解能構造昆虫 RyR チャネルの開閉機構を明らかにし、構造基づかせていた薬剤の設計を使用して特異的殺虫剤の開発の重要なテンプレートが提供するために報告します。構造解明のため近くの原子分解能での蛋白質の構造の決定の「ゴールド スタンダード」として考慮される x 線結晶解析を採用。結晶化プロセスは予測不可能な労働集約的なこのステップバイ ステップのプロトコルはエクスプレス、浄化し、一般的に昆虫 RyR または他の蛋白質の他のドメインを特徴づける研究者に役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では recombinantly エクスプレス、浄化、結晶化、DBM RyR NTD の構造を決定する手順をについて説明します。結晶化の重要な要件は、高溶解性、純度、均一性タンパク質を得ることです。プロトコル、hexahistidine タグとより高い倍純度を取得する浄化に利用できるどちらの MBP タグが含まれているペット 28 a HMT ベクターを使用にしました。さらに、MBP タグがターゲット蛋白質の溶解度で補助さ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究によって提供された資金: キー研究と開発中国プログラムの (2017YFD0201400、2017YFD0201403)、国家自然科学基金、中国の (31320103922、31230061) との国民基礎研究プロジェクト (973) プログラム中国 (2015CB856500、2015CB856504)。ビームライン BL17U1 上海シンクロトロン放射光施設 (SSRF) でスタッフに感謝しております。
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
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