N 맨끝 도메인의 Ryanodine 수용 체 이용한 배 xylostella 에서 결정 구조

Summary

이 문서에서는, 우리는 다이아몬드 나 방 (이용한 배 xylostella)에서 ryanodine 수용 체의 N 맨끝 도메인의 단백질 식, 정화, 결정 화 및 구조 결정의 프로토콜 설명합니다.

Abstract

곤충 ryanodine 수용 체 (RyRs)를 대상으로 하는 강력 하 고 효율적인 살충제의 개발 농업 해충의 영역에 큰 관심의 되었습니다. 까지, 몇몇 diamide 살충제 RyRs 상용화 되었습니다 해충을 대상으로는 2 십억 미국 달러의 연간 수익을 생성 합니다. 그러나 RyR 타겟팅 살충제의 행동의 모드의 이해 구조 정보 곤충 RyR의 부족에 의해 제한 된다. 이 차례로 해충에 살충제 저항 개발의 이해를 제한합니다. 다이아몬드 나 방 (DBM) diamide 살충제에 저항을 표시를 보고도 전세계, 십자화과 작물 파괴 엄청난 해충 이다. 그러므로, DBM RyR, 특히 전통적인 diamide 바인딩 사이트에서 다른 영역을 대상으로 타겟팅 새로운 살충제를 개발 하는 실용적인 중요성의 이다. 여기, 선물이 구조적 특성 DBM에서 RyR의 N 맨끝 도메인 프로토콜. X 선 결정 구조 분자 교체는 해상도에 의해 해결 되었다 Å는 2.84의 베타-개미 자리의 접는 모티브와 측면에 서 알파 나선 보여줍니다. 이 프로토콜은 일반적으로 식, 정화와 다른 도메인 또는 단백질의 구조적 특성에 대 한 적응 될 수 있다.

Introduction

Ryanodine 수용 체 (RyRs)은 근육 세포에 sarcoplasmic 그물 (SR) 세포 막에 걸쳐 캘리포니아^{2 +} 이온의 투과 중재 하는 특정 이온 채널입니다. 따라서, 그들은 흥분 수축 연결 과정에서에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 기능 형태의 RyR의 분자 질량을 가진 호모 tetramer로 조립 > ~ 5000 아미노산 잔류물의 구성 하는 각 소 단위와 2 MDa. 포유류에서 3 개의 isoforms는: RyR1 골격 근육 형, RyR2-심장 근육 유형 및 RyR3-다른 조직¹편 표현.

곤충에는 근육과 신경 조직²에서 표현 RyR의 한 유형이 있다.입니다. 곤충 RyR 비슷합니다 더 약 47%의 시퀀스 id 가진 포유류 RyR2³. 타겟팅 RyR의 나비목과 딱정벌레목 Diamide 살충제를 개발 하 고 바이엘 (flubendiamide), 듀 폰 (chlorantraniliprole) 및 Syngenta (cyantraniliprole) 같은 주요 기업에 의해 판매 되었습니다. 비교적 최근 출시 이후, diamide 살충제 살충제의 급성장 클래스 중 하나가 되고있다. 현재, 매년 이러한 세 가지 살충제의 판매는 2009 (Agranova) 이후 50% 이상의 성장 율을 가진 2 십억 미국 달러를 넘어 있다.

최근 연구 결과 이러한 살충제^4,,56,,78의 사용의 몇 세대 후에 곤충 저항 개발을 보고 있다. 저항 막 횡단 영역에서의 변이 RyRs 다이아몬드 나 방 (DBM), 이용한 배 xylostella (G4946E, I4790M)와 토마토 leafminer에 해당 위치에서 Tuta absoluta (G4903E, I4746M) 표시 하는 지역 로이 지역 채널^4,,89의 게이팅에 대 한 중요 한 것으로 알려져 있다 diamide 살충제 바인딩에 참여 수 있습니다. 이 지역에 광범위 한 연구에도 불구 하 고 diamide 살충제의 정확한 분자 메커니즘 애매 남아 있습니다. 또한, 그것은 하지 분명 여부 저항 돌연변이 영향을 diamides와의 상호 작용 또는 allosterically입니다.

포유류 종에서 여러 RyR 도메인의 구조와 전장 포유류 RyR1 및 RyR2의 구조 엑스레이 결정학 그리고 cryo 전자 현미경 검사 법, 각각^{10,11에 의해 이전 연구 보고가 12,13,14,15,,1617,18,19,20,21} . 하지만 지금까지, 아니 구조 곤충 RyR의 보고 되었습니다,이 이해는 분자의 복잡 한 수용 체 기능 뿐만 아니라 살충제 행동의 분자 메커니즘 및 살충제 저항의 개발에서 우리를 금지.

이 원고에서 선물이 다이아몬드 나 방, 파괴적인 해충 감염 십자화과 작물 전세계²²에서 ryanodine 수용 체의 N 맨끝 β-개미 자리의 도메인의 구조적 특성에 대 한 일반화 된 프로토콜. 게시 된 토끼 RyR1 NTD 크리스탈 구조^23,24및 곳을 알아내는-그들 구조 모델^16,17,,1819, 는 구조 설계 되었다 ^{20 , 21}. 이것은 최초의 고해상도 구조 곤충 RyR 채널 게이팅 메커니즘을 밝혀 고 구조 기반 약물 설계를 사용 하 여 종의 살충제의 개발에 대 한 중요 한 서식 파일을 제공 합니다에 대 한 보고. 구조 설명, 우리 사용 엑스레이 결정학, 원자 해상도 근처에서 단백질 구조 결심을 위한 ‘ 골드 표준 ‘으로 간주 됩니다. 결정 화 과정은 예측할 수 없는 노동 집약, 비록이 단계별 프로토콜 표현, 정화 및 곤충 RyR 또는 다른 단백질의 다른 도메인의 일반적 특성 연구를 도울 것 이다.

Protocol

1. 유전자 복제, 단백질 표정과 정화 PCR 증폭 관심사의 단백질에 해당 하는 DNA (DBM RyR, 은행의 잔류물 1-205 없음 acc.. AFW97408) 및 결 찰 독립적인 복제 (LIC)25애완 동물-28a-HMT 벡터에 클론. 이 벡터 포함 히스티딘 태그, MBP 태그와 N-말단에 TEV protease 분열 사이트15. LIC 호환 5′ 확장명을 가진 대상 유전자의 증폭에 대 한 디자인 LIC 뇌관:LIC ?…

Representative Results

정화 DBM RyR의 N 맨끝 도메인 TEV protease 분열 사이트, MBP 태그와 hexahistidine 태그 융합 단백질으로 표현 했다. 우리는 매우 순수한 단백질 결정 화 목적에 적합을 얻기 위해 5 단계 정화 전략을 따 랐 다. 처음에, 융해 단백질 Ni NTA 열 (HP HisTrap)에 의해 세포 lysate의 녹는 분수에서 순화 했다. 다음으로, TEV protease 분열 융해 단백질은 대?…

Discussion

이 문서에서 우리는 recombinantly 익스프레스, 정화, 구체화 및 DBM RyR NTD의 구조를 결정 하는 절차를 설명 합니다. 결정 화에 대 한 중요 한 요구 사항이 높은 용 해도, 순도와 균질 단백질을 얻을 것입니다. 우리의 프로토콜에서 우리는 hexahistidine 태그와 MBP, 둘 다 더 높은 배 순도를 정화에 대 한 활용 될 수 포함 되어 애완 동물-28a-HMT 벡터를 사용 하기로 결정 했다. 또한,는 MBP 태그 에이즈 대상 단백?…

Materials

pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop – 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37