Crystal struktur av N-terminal domenet av Ryanodine reseptoren fra Plutella xylostella

Summary

I denne artikkelen beskrive vi protokoller av protein uttrykk, rensing, krystallisering og struktur fastsettelse av N-terminal domenet ryanodine reseptoren fra diamondback møll (Plutella xylostella).

Abstract

Utvikling av potente og effektive insektmidler målretting insekt ryanodine reseptorer (RyRs) har vært av stor interesse innen landbruk skadedyrbekjempelse. Hittil har flere diamide insektmidler målretting pest RyRs har blitt kommersialisert, som genererer årlig omsetning på 2 milliarder amerikanske dollar. Men forståelse av modusen for handling av RyR målretting insektmidler er begrenset av mangel på strukturelle informasjon om insekt RyR. Dette begrenser igjen forståelse av utviklingen av insektmiddel motstand i skadedyr. Diamondback møll (DBM) er en ødeleggende pest ødelegge cruciferous avlinger over hele verden, som har også blitt rapportert å vise motstand mot diamide insektmidler. Derfor er det av stor praktisk betydning å utvikle romanen insektmidler målretting DBM RyR, spesielt rettet mot en region forskjellig fra det tradisjonelle diamide binding området. Her presenterer vi en protokoll strukturelt betegner N-terminal domenet RyR fra DBM. Krystallstruktur x-ray ble løst av molekylære erstatning oppløsning av 2.84 Å, som viser en beta-trefoil folding motiv og en flankemanøveren alpha helix. Denne protokollen kan tilpasses for uttrykket, rensing og strukturelle karakteristikk av andre domener eller proteiner generelt.

Introduction

Ryanodine reseptorer (RyRs) er bestemt ionekanaler, som megle gjennomtrengning av Ca^{2 +} ioner over sarcoplasmic retikulum (SR) membraner i muskelceller. Derfor spille de en viktig rolle i magnetisering sammentrekning kopling prosessen. I sin funksjonelle form, RyR samler som en homo-tetramer med en molekylær masse > 2 MDa, med hver delenhet bestående av ~ 5000 aminosyre rester. I pattedyr, finnes det tre isoformene: RyR1 – Skjelettmuskel type, Hjertemuskel type RyR2- og RyR3-overalt uttrykt i forskjellige vev¹.

I insekter er det bare én type RyR, som er uttrykt i muskel- og nervøs vev². Insekt RyR er mer lik pattedyr RyR2 med en sekvens identitet på ca 47%³. Diamide insektmidler målretting RyR av sommerfugler og Coleoptera er utviklet og markedsført av store selskaper som Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) og Syngenta (cyantraniliprole). Siden lanseringen relativt nylig har diamide insektmidler blitt en av de raskest voksende klassen av insektmidler. Foreløpig har salget av disse tre insektmidler årlig krysset 2 milliarder amerikanske dollar med en vekst på mer enn 50% siden 2009 (Agranova).

Nyere studier har rapportert utviklingen av motstand i insekter etter et par generasjoner av bruken av insektmidler^4,5,6,7,8. Den motstand mutasjoner i transmembrane domenet av RyRs fra diamondback møll (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) og de tilsvarende stillingene i tomat leafminer, Tuta reservatet (G4903E, I4746M) viser at regionen kan være involvert i diamide insektmiddel binding som denne regionen er kjent for å være kritisk for gating av channel^4,8,9. Til tross for omfattende forskning på dette området forblir nøyaktig molekylære mekanismer av diamide insektmidler unnvikende. Videre er det uklart om motstand mutasjoner påvirker interaksjonene med diamides direkte eller allosterically.

Tidligere studier har rapportert strukturen i flere RyR domener pattedyrarter og strukturen i full lengde pattedyr RyR1 og RyR2 av Røntgenkrystallografi og cryo-elektronmikroskop, henholdsvis^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Men så langt ingen struktur av insekt RyR er rapportert, som forbyr oss fra å forstå molekylær vanskelighetene med funksjonen reseptor og molekylære mekanismer insektmiddel handling og utvikling av insektmiddel motstand.

I dette manuskriptet presenterer vi en generalisert protokoll for strukturelle karakterisering av N-terminal β-trefoil domene ryanodine reseptoren fra diamondback møll, en ødeleggende pest infisere cruciferous avlinger verdensomspennende²². Konstruer ble utviklet etter publiserte kanin RyR1 NTD krystall strukturer^23,24og cryo-EM strukturelle modeller^{16,17,18,19, 20 , 21}. Dette er første høyoppløselig strukturen rapportert insekt RyR, som avslører mekanismen for kanal gating og gir en viktig mal for utviklingen av artsspesifikke insektmidler ved hjelp av strukturen-basert stoff design. For strukturen forklaring ansatt vi Røntgenkrystallografi, som regnes som “gull standard’ for protein proteinstrukturer på nær Atom løsning. Selv om krystallisering prosessen er uforutsigbare og arbeidsintensiv, vil denne trinnvise protokollen hjelpe forskere til å uttrykke, rense og karakterisere andre domener av insekter RyR eller noen andre proteiner generelt.

Protocol

1. gen kloning, Protein uttrykk og rensing PCR forsterke DNA tilsvarer protein av interesse (rester 1-205 av DBM RyR, Genbank iht. no. AFW97408) og klone i pET-28a-HMT vektor av hemorroider-uavhengig kloning (LIC)25. Denne vektoren inneholder en histidin kode, MBP tag og en TEV protease cleavage nettsted på N-terminus15. Design LIC primere for forsterkning av målet genet med LIC-kompatible 5 utvidelser:Videresend LIC primer:5′ …

Representative Results

Rensing N-terminal domenet DBM RyR ble uttrykt som en fusion protein med en hexahistidine kode, MBP koder og et TEV protease cleavage område. Vi fulgte en fem-trinns rensing strategi for å få en svært ren protein, egnet for krystallisering formålet. Først var fusion protein renset fra løselig brøkdel av celle lysate Ni-NTA kolonnen (HisTrap HP). Deretter fusion protein ble utsatt for TEV protease cleavage og hexahistidine-M…

Discussion

I dette papiret beskriver vi fremgangsmåten for å recombinantly express, rense, utkrystallisere og bestemme strukturen i DBM RyR NTD. For krystallisering er et viktig krav å skaffe proteiner med høy løselighet, renhet og homogenitet. I vår protokollen valgte vi å bruke pET-28a-HMT vektor som inneholder en hexahistidine kode og MBP tag, begge kan utnyttes for rensing å få en høyere fold renhet. I tillegg MBP tag aids i Løseligheten av målet protein. Vi renset protein av fem sammenhengende trinn som hadde prote…

Materials

pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop – 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37