Kristallstrukturen av N-terminala domänen av ryanodinreceptorn från Plutella xylostella
Summary
I den här artikeln beskriver vi protokoll av protein uttryck, rening, kristallisering och struktur bestämning av N-terminala domänen för ryanodinreceptorn från diamondback moth (Plutella xylostella).
Abstract
Utvecklingen av potenta och effektiva insektsmedel inriktning insekt ryanodine receptorer (RyRs) har varit av stort intresse i området i jordbruket skadedjursbekämpning. Hittills har flera diamide insekticider inriktning pest RyRs har kommersialiserats, som genererar omsättning om 2 miljarder US-dollar. Men förståelsen av verkningsmekanismen av RyR-targeting insekticider begränsas av bristen på strukturell information angående insekt RyR. Detta begränsar i sin tur förståelsen av insektsmedel resistensutveckling i skadedjur. Diamondback mal (DBM) är ett förödande skadedjur som förstör korsblommiga grödor i världen, som har också rapporterats att Visa motstånd mot diamide insekticider. Därför är det av stor praktisk betydelse att utveckla nya insekticider inriktning den DBM RyR, särskilt inriktning en region som skiljer sig från traditionella diamide bindningsstället. Här presenterar vi ett protokoll för att strukturellt karakterisera den N-terminala domänen av RyR från DBM. X-ray kristallstrukturen löstes genom molekylär ersätter en upplösning av 2.84 Å, som visar ett beta-klöver fällbara motiv och en kompletterande alpha helix. Detta protokoll kan anpassas för uttryck, rening och strukturell karaktärisering av andra domäner eller proteiner i allmänhet.
Introduction
Ryanodine receptorer (RyRs) är specifika jonkanaler, som medlar genomträngning av Ca2 + joner över de sarkoplasmatiska Retikulum (SR) membran i muskelcellerna. Därför, de spelar en viktig roll i excitation contractionen koppling processen. I sin funktionella form, RyR monterar som en homo-tetramer med en molekylvikt av > 2 MDa, med varje subenhet bestående av ~ 5000 aminosyra rester. Hos däggdjur finns det tre isoformer: RyR1 – skelettmuskulaturen typ, hjärtmuskulatur typ RyR2- och RyR3-ubiquitously uttryckt i olika vävnader1.
I insekter finns det endast en typ av RyR, som uttrycks i muskulös och nervös vävnad2. Insekt RyR är mer lik däggdjur RyR2 med en sekvens identitet av cirka 47%3. Diamide insekticider inriktning RyR av Lepidoptera och Coleoptera har utvecklats och marknadsförs av stora företag som Bayer (flubendiamid), DuPont (klorantraniliprol) och Syngenta (cyantraniliprole). Sedan lanseringen relativt nyligen har diamide insekticider blivit en av de snabbast växande klassen av insekticider. För närvarande har försäljningen av dessa tre insekticider årligen passerat 2 miljarder US-dollar med en tillväxttakt på mer än 50% sedan 2009 (Agranova).
Nyligen genomförda studier har rapporterat resistensutveckling hos insekter efter några generationer av användningen av dessa insektsmedel4,5,6,7,8. Resistensmutationer i domänen transmembrana av RyRs från diamondback mal (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) och motsvarande positioner i tomat leafminer, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) visar att regionen kan vara inblandade i diamide insektsmedel bindande eftersom denna region är känd för att vara kritiska för gating av channel4,8,9. Trots omfattande forskning på detta område fortfarande de exakta molekylära mekanismerna av diamide insekticider gäckande. Dessutom är det oklart huruvida resistensmutationer påverkar interaktionen med diamides direkt eller allosterically.
Tidigare studier har rapporterat strukturen för flera RyR domäner från däggdjursarter och struktur fullängds däggdjur RyR1 och RyR2 av röntgenkristallografi och cryo-elektronmikroskopi, respektive10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Men hittills har ingen struktur av insekt RyR har rapporterats, som förbjuder oss från att förstå funktionen receptor molekylär krångligheter samt insektsmedel molekylära verkningsmekanismer och insektsmedel resistensutveckling.
I detta manuskript presenterar vi en generaliserad protokoll för strukturella karakterisering av N-terminala β-klöver domänen för ryanodinreceptorn från diamondback mal, en destruktiv pest som infekterar korsblommiga grödor i världen22. Konstruktionen utformades enligt den publicera kanin RyR1 NTD crystal strukturer23,24och cryo-EM strukturella modeller16,17,18,19, 20 , 21. Detta är den första högupplösta strukturen som rapporterats för insekt RyR, som avslöjar mekanismen för kanal gating och ger en viktig mall för utvecklingen av artspecifika insekticider använder strukturbaserad design. För struktur klarläggande anställt vi röntgenkristallografi, som är ansedd som den ‘gold standarden’ för protein strukturbestämning på nära atomär upplösning. Även om kristallisation är oförutsägbar och arbetsintensivt, hjälper detta stegvisa protokoll forskare att uttrycka, rena och karakterisera andra domäner av insekt RyR eller några andra proteiner i allmänhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta papper beskriver vi förfarandet för att recombinantly express, rena, kristallisera och utreda strukturen av DBM RyR NTD. För kristallisering är ett viktigt krav att få proteiner med hög löslighet, renhet och homogenitet. I våra protokoll valde vi att använda pET-28a-HMT vektor eftersom det innehåller en hexahistidine-tagg och MBP tagg, som båda skulle kunna utnyttjas för rening att erhålla en högre fold renhet. Dessutom de MBP tag aids i målproteinet löslighet. Vi renat protein av fem på varandra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering för denna forskning lämnades av: nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nationella natur Science Foundation of China (31320103922, 31230061) och projekt av nationell grundforskning (973) Program för Kina (2015CB856500, 2015CB856504). Vi är tacksamma till Personalen på beamline BL17U1 på Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
References
- Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
- Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
- Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
- Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
- Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
- Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
- Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
- Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
- Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
- Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
- Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
- Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
- Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
- Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
- Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
- Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
- Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
- Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution–from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
- Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
- Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).
