En este artículo, se demuestra cómo se realiza la técnica de microbiopsy absorbente y cómo se puede utilizar la muestra para la extracción de RNA para muestreo simple y simultánea de la piel y la sangre de una manera mínimamente invasiva.
Biopsia de piel convencionales limita la investigación clínica que involucra áreas cosméticamente sensibles o aplicaciones pediátricas debido a su invasividad. Aquí, describimos el protocolo para el uso de un dispositivo absorbente de microneedle, microbiopsy absorbente, para muestreo mínimamente invasiva de la mezcla de piel y sangre. Nuestro objetivo es ayudar a facilitar un rápido progreso en la investigación clínica, el establecimiento de biomarcadores para la enfermedad de la piel y reducir el riesgo para los participantes de la investigación clínica. En contraste con técnicas de biopsia de piel convencionales, microbiopsy absorbente puede realizarse en segundos y no requiere entrenamiento intensivo debido a su diseño simple. En este informe, describimos el uso de microbiopsy absorbente, incluyendo carga y aplicación, en un voluntario. A continuación, mostramos cómo aislar RNA de la muestra absorbida. Finalmente, se demuestra el uso de cuantitativo transcripción reversa PCR (RT-qPCR) para cuantificar los niveles de expresión de mRNA de sangre (CD3E y CD19) y piel (KRT14 y TYR). Los métodos que describimos a utilizan kits de estante y reactivos. Este protocolo ofrece un acercamiento como mínimo invasor para el muestreo simultáneo de la piel y la sangre dentro de la misma matriz absorbente microbiopsy. Hemos encontrado los comités de ética humana, los médicos y voluntarios que apoyan este enfoque a la investigación dermatológica.
Biopsia de la piel es una de las técnicas más esenciales en dermatología para la toma de muestras de piel y posterior diagnóstico de enfermedades de la piel a través de la evaluación histopatológica. La técnica de biopsia implica a un profesional médico mediante una biopsia de la lámina o punzón para eliminar la lesión sospechosa en la piel del paciente para examen1. Aunque la técnica es eficaz, es altamente invasivo y limita la investigación clínica como el punto final generalmente involucra técnicas de biología molecular2,3. Análisis molecular de enfermedades de la piel tiene el potencial para proporcionar información biológica altamente específico que no puede el análisis histopatológico, facilitando así la droga descubrimiento y enfermedad diagnóstico4,5. Además, la demanda de la muestra en técnicas moleculares más es comparativamente pequeña y puede conducir a una reducción en el uso de animales y permitir un mayor número de repeticiones. Por lo tanto, existe una clara necesidad de una técnica alternativa que permite el análisis molecular en la investigación clínica y disminuye el riesgo para los participantes.
Para hacer frente a tanta necesidad en el campo, nuestro grupo ha desarrollado una novedosa plataforma de diagnóstico base de microneedle, microbiopsy absorbente, que permite la recopilación de una pequeña cantidad de piel mezclada con la sangre en una manera simple y mínimamente invasivo6. El propósito de esta publicación es describir la microbiopsy absorbente como una herramienta de toma de muestras para facilitar el análisis molecular mediante la extracción de RNA en la investigación clínica.
Anteriormente, hemos descrito la primera versión de microbiopsy, microbiopsy de la piel, que consiste en un microneedle de un diseño de placa de acero de tres capas para extraer pedazos diminutos de piel tejidos7. La novedad de este aparato proviene de los múltiples puntos de contacto de la microneedle que permite la extracción de tejido eficiente3. En cambio, una biopsia del sacador de piel circular proporciona un único punto de contacto y simplemente se rasga la piel sin capturar cualquier muestra en algunos casos. Basado en la microbiopsy de la piel, hemos desarrollado recientemente el microbiopsy absorbente que tiene sangre y piel capacidades de muestreo. El dispositivo ha demostrado ser factible para el uso en áreas de escasos recursos en un reciente estudio epidemiológico6.
Debido a su diseño simple, la microbiopsy absorbente puede realizarse en unos pocos segundos y no requiere de un entrenamiento extensivo. Además, no se necesita anestesia local y el sitio de aplicación no causa cicatrización. El presente Protocolo permite a investigadores o profesionales de la medicina sin el correspondiente muestreo para obtener datos específicos de la piel para el análisis molecular. Esperamos microsampling dispositivos para convertirse en rutina en la investigación de la piel en el futuro.
Aunque el microbiopsy se ha reportado en otros estudios de enfermedades de la piel que las técnicas de diagnóstico molecular6,8,9,10, como el virus del papiloma humano detección de ADN, este protocolo es el primero en demostrar los detalles de las técnicas de extracción y procesamiento de muestra para la microbiopsy absorbente. Además, este es el primer informe que describe los perfiles de expresión génica relativa de la piel y las células de la sangre en las muestras de microbiopsy.
Estos resultados demuestran que el microbiopsy absorbente puede utilizarse como una herramienta para muestreo simple y mínimamente invasivo de la piel y la sangre mezcla para caracterización molecular. Aplicación del dispositivo según nuestro protocolo es esencial para obtener resultados fiables como se indica por la diferencia en la cantidad de RNA con protocolos de aplicación diferentes (figura 3). Una vez extraída la muestra, la muestra posterior procesamiento paso para extracción de RNA es muy similar a protocolos establecidos15,16. Además de los pasos iniciales en la extracción de RNA que son modificados para lo microbiopsy absorbente, otro cambio clave es el uso de agua libre de ARNasa para mejorar los resultados para aplicaciones posteriores. Por otra parte, cabe mencionar que el gen de referencia utilizado en este estudio es RPLP0. RPLP0, cuya función es conocida por diferentes células y tejidos tipos17, se ha divulgado como un gen de referencia adecuados para el uso en cánceres de piel no melanoma y lesiones precancerosas18.
Una de las principales limitaciones del dispositivo es la eliminación de la microbiopsy desde el dispositivo, que es desperdiciador de tiempo y aumenta potencialmente la posibilidad de pérdida de muestra, especialmente para muestras sensibles como RNA. Sin embargo, el problema puede superarse la prerefrigeración todas las herramientas de procesamiento estéril, como los tubos de microcentrífuga de 2 mL en hielo seco.
El uso de la microbiopsy absorbente es simple y no requiere entrenamiento intensivo. Biopsia convencional no es necesaria microbiopsy permite la caracterización molecular con técnicas de diagnóstico molecular establecido, como RT-qPCR. Para cuantificar y demostrar la capacidad de muestreo de microbiopsy absorbente, se investigó la literatura anterior que involucró la extracción del RNA de tejidos de la piel humana. Biopsia en sacabocados de una típico 3.0 o 4.0 mm la piel, tres estudios han reportado la cantidad de RNA extraída osciló entre 50 y 200 ng por mg de tejido de piel19,20,21. Comparando con el 1,43 ng de RNA que se recuperó de la microbiopsy absorbente en promedio (figura 3), el peso de los tejidos de la piel muestra se espera al rango de 0.29-115 μg basada en la misma proporción de RNA en tejido de los estudios de biopsia de piel punch.
Este protocolo no está sin peligros potenciales, aunque algunos de los problemas pueden superarse fácilmente. Por ejemplo, los datos de extracción de RNA sugirieron una variación considerable con el tiempo de mantenimiento de 10-s (figura 3). Para abordar el problema, una posible solución consiste en optimizar el protocolo de aplicación. Parámetros como la fuerza aplicación a la piel y tiempo de retención debe ser probado y optimizado para reducir las variaciones en la extracción de la muestra. El otro problema potencial es la eliminación de microbiopsy desde el dispositivo, que podría afectar la integridad de la muestra y la recuperación. Aunque la eliminación de la microbiopsy para la extracción de RNA es un enfoque eficaz, todo el procedimiento es tedioso, y la muestra puede estar expuesta a la contaminación en el proceso. Por lo tanto, la modificación del Protocolo de procesamiento de muestra es altamente deseada con el fin de garantizar la integridad de la muestra y evitar la pérdida de muestra.
Una vez que se abordan las dos cuestiones anteriores, se espera que el dispositivo se convertirá en una herramienta estándar para la investigación clínica. Es importante tener en cuenta que el dispositivo captura muestra de piel y sangre al mismo tiempo y esto debería tenerse en cuenta cuando se analizan datos de expresión genética. En conclusión, este protocolo describe los detalles de la realización de microbiopsy absorbente como una herramienta fácil y mínimamente invasiva para piel combinada y tomar muestras de sangre y la posterior muestra de procesamiento para el perfil de expresión génica relativa.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría reconocer NHMRC becas APP1109749 y APP1111216, Universidad de Queensland centenario beca y beca de investigación Postgrado Internacional.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |