سباتيوتيمبورالي الخاضعة لسيطرة النووية إزفاء من الضيوف في الخلايا الحية باستخدام الغراء الجزيئية محبوس كالعلامات فوتواكتيفاتابل
Summary
ويصف هذا البروتوكول إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف في الخلايا الحية باستخدام العلامات الغراء الجزيئية محبوس. هذا الأسلوب واعدة لإيصال الأدوية النووية الاستهداف الانتقائي الموقع.
Abstract
نواة الخلية واحدة من العضيات الأكثر أهمية كهدف إيصال الأدوية سوبسيلولار، منذ التحوير الجيني النسخ المتماثل والتعبير فعالة لعلاج الأمراض المختلفة. هنا، علينا أن نبرهن إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف استخدام قفص العلامات الجزيئية الغراء (قفصالغراء-R)، الذين المعلقات أيون (قو+) جوانيدينيوم متعددة محمية بواسطة جماعة فوتوكليفابل أنيونى (butyrate محل نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل؛ مكتبة الإسكندرية نفوك). يجري تناول الضيوف الموسومة محبوسالغراء-R في المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام، وتبقى في اندوسوميس. ومع ذلك، عند فوتويرادييشن، يتم تحويل محبوسالغراء-R في أونكاجيد الجزيئية الغراء (الغراءUncaged-R) تحمل المعلقات قو+ متعددة، مما يسهل الهروب اندوسومال وازفاء النووية اللاحقة للضيوف. هذا الأسلوب واعدة بالنسبة للموقع انتقائية النووية تستهدف إيصال المخدرات، حيث يمكن ترحيل الضيوف كلمات داخل السيتوبلازم متبوعاً بنواة الخلية فقط عندما فوتويرادياتيد. قفص يمكن تسليم العلامات الغراء-R الضيوف الجزيئات مثل نقاط الكم (قدس) فضلا عن الضيوف جزيء صغير. قفص يمكن أن تكون العلامات الغراء-R أونكاجيد مع الأشعة فوق البنفسجية ليس فقط ولكن أيضا الضوء اثنين-فوتون (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، والتي يمكن اختراق عميق في الأنسجة.
Introduction
نواة الخلية، التي تحمل المعلومات الوراثية، واحدة من العضيات الأكثر أهمية كهدف إيصال الأدوية سوبسيلولار، منذ التحوير الجيني النسخ المتماثل والتعبير فعالة لعلاج الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان والوراثية اضطرابات1،،من23. النووية تسليم المخدرات، وتصريف الببتيد العلامات مثل التعريب النووية إشارات (NLS)4،،من56 تم التحقيق على نطاق واسع. ومع ذلك، بغية الحد من الآثار الجانبية غير المرغوب فيها، مراقبة الزمانية المكانية لنقل جسد النووية ضروري.
سابقا، أحرز إزفاء آثار خفيفة من البروتينات في نواة الخلية باستخدام قفص NLS7،،من89. وترحيل NLS في نواة الخلية بالربط بالنقل هيولى البروتينات6. في أساليب الإبلاغ عنها، هي مباشرة أدمج السيتوبلازم microinjection8 ضيف بروتينات تحمل NLS محبوس أو المعرب عنها في الخلايا المستهدفة باستخدام تقنية توسيع الشفرة الجينية9. ولذلك، أسلوب الذي يمكن أن يحقق الإقبال على الهاتف الخلوي والمستحثه بالصورة النووية إزفاء مفيداً للتطبيقات العملية.
هنا، يمكننا وصف إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف في الخلايا الحية باستخدام العلامات الجذعية الغراء الجزيئية محبوس (محبوسالغراء-R، الشكل 1). الالتصاق الجزيئية للذوبان في الماء10،11،12،13،14،15،16،،من1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 واضعة متعددة قو+ المعلقات سابقا ووضعت أحكام التي تلتزم بالبروتينات11،،من1213،،من1415، 16،17والأحماض النووية18،،من1920و الأغشية فسفوليبيد21وطين نانوشيتس22،23 من خلال تشكيل جسور الملح متعددة بين المعلقات قو+ والجماعات أوكسيانيونيك على الأهداف. المعلقات قو+ آر الغراء محبوسمحمية بجماعة فوتوكليفابل أنيونى، الاستعاضة عن بوتيرات نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل (بانفوك). يجري تناول الضيوف الموسومة محبوسالغراء-R في المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام وإقامتهم في اندوسوميس (الشكل 2). عند فوتويرادييشن، يتم فصل مجموعات نفوك با محبوسالغراء-R العائد أونكاجيد جزيئية غراء (Uncagedالغراء-R) تحمل المعلقات قو+ متعددة، مما يسهل الهجرة الضيف المعلمة ثم في السيتوبلازم متبوعاً بنواة الخلية (الشكل 2). يمكن أن تكون العلامة الغراء-R محبوسأونكاجيد بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية أو اثنين-فوتون الضوء (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء دون لالضيائيه خطيرة. ونحن تثبت تسليم النووية الخاضعة للرقابة سباتيوتيمبورالي الجزيئات الضيوف، فضلا عن الضيوف جزيء صغير محبوسالغراء-R به، مع استخدام نقاط الكم (قدس) وصبغة فلورسنت (نيتروبينزوكساديازولي؛ بنك دبي الوطني)، على التوالي، كأمثلة.
الشكل 1: الهياكل التخطيطي محبوسالغراء-ر. المعلقات أيون (قو+) جوانيدينيوم 9 من الغراء محبوس-R محمية بمجموعة نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل محل butyrate (بانفوك). هي مجموعات نفوك باالمشقوق التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية أو اثنين-فوتون ضوء الجرد. هو فونكتيوناليزيد جوهر محبوسالغراء-R التنسيق مع نيتروبينزوكساديازولي (دبي) أو ديبينزوسيلوكتيني (دبكو). طبع بإذن من المرجع20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: توضيح التخطيطي لتشغيل ضوء النووية إزفاء الضيوف مترافق مع علامة غراء-R محبوس. الضيف/هو تناول المتقارن الغراء-Rمحبوسفي المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام. عند فوتويرادييشن، علامة الغراء-R محبوسأونكاجيد أن تسفر عن علامة غراء-R Uncaged، التي يمكن أن تسهل هروب اندوسومال الضيف المعلمة. وفي وقت لاحق، ترحيل الضيف المعلمة إلى نواة الخلية. طبع بإذن من المرجع20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد تحققت التحقيقات السابقة من إزفاء آثار خفيفة من البروتينات في نواة الخلية باستخدام قفص NLS7،،من89. وكما ذكر آنفا، هذه الأساليب تتطلب تقنيات إضافية دمج البروتينات معلم NLS في السيتوبلازم. على النقيض من ذلك، يتيح لنا العلامة الغراء-R محبو…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف المركز “التكامل نانوبيو”، وجامعة طوكيو. هذا العمل كان يدعمها معونات للشباب العلماء (ب) (26810046) إلى كو ودعمها جزئيا من معونات “بحوث الترويج خصيصا” (25000005) إلى “جمهورية مقدونيا يأتون” بفضل “الزمالات البحثية من الجمعية اليابانية” لتعزيز العلوم (JSPS ) للعلماء الشباب وبرنامج المدارس الرائدة في الدراسات العليا (جبلي).
Materials
| Azide-PEG4-NHS ester | Click Chemistry Tools | AZ103 | |
| Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
| Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
| Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
| Hep3B Cells | ATCC | HB-8064 | |
| 8-chambered glass substrate | Nunc | 155411JP | |
| 96-well culture plate | Nunc | 167008 | |
| Eagle's minimal essential medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) | Wako Pure Chemical Industries | 045-29795 | |
| LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
| Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl-Zeiss | LSM 510 | Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Xenon light source | Asahi Spectra | LAX-102 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |
References
- Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
- Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
- Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
- Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
- Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
- Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
- Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
- Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
- Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
- Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
- Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
- Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
- Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
- Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
- Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
- Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
- Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
- Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
- Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
- Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
- Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
- Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
- Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
- Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimie. 48, 6571-6584 (2009).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).
