Spatiotemporally מבוקר גרעיני טרנסלוקציה של האורחים בתאים חיים באמצעות דבקים מולקולרית בכלובים כמו Photoactivatable תגיות

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

פרוטוקול זה מתאר מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים בתאים חיים באמצעות תגי דבק מולקולרית בכלובים. שיטה זו היא מבטיחה עבור משלוח סמים פילוח גרעיני האתר סלקטיבית.

Abstract

גרעין התא הוא אחד organelles החשובים ביותר כמטרה סמים subcellular-מסירה, מאז אפנון של שכפול גנטי, הביטוי הוא יעיל לטיפול במחלות שונות. . הנה, נדגים מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים שימוש בכלוב תגיות דבק מולקולרית (^בכלובדבק-R), תליונים יון (ג. א.⁺) מרובות של מי guanidinium מוגנים על-ידי קבוצת anionic photocleavable (butyrate-שהוחלפו nitroveratryloxycarbonyl; ^BA NVOC). האורחים המתויגת ^כלואהדבק-R נלקחים לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה וישארו endosomes. עם זאת, בעת photoirradiation, ^כלואהדבק-R מומר שברחה מכלוב מולקולרית דבק (^Uncagedדבק-R) תליונים גו⁺מרובים, נושאת המאפשרת את הבריחה endosomal ואת רוברטסונית גרעיני עוקבות של האורחים. בשיטה זו הוא מבטיח למסירה אתר סלקטיבית הגרעיני פילוח סמים, מאז מתויג האורחים יכולים להעביר לתוך הציטופלסמה ואחריו גרעין התא רק כאשר photoirradiated. ^בכלוב דבק-R תגיות יכול לספק לאורחים macromolecular כגון נקודות קוונטיות (QDs) כמו גם האורחים מולקולה קטנה. ^בכלוב תגיות דבק-R ניתן שברחה מכלוב עם לא רק אור UV, אלא גם שני הפוטונים-סגול (ניר) אור, אשר יכול לחדור עמוק לתוך רקמות.

Introduction

גרעין התא, אשר נושאת מידע גנטי, הוא אחד organelles החשובים ביותר כמטרה סמים subcellular-מסירה, מאז אפנון של שכפול גנטי, הביטוי הוא יעיל לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן ותעשיה והפרעות¹^,²^,³. למסירה הגרעין של סמים, ההטיה של פפטיד תיוג כגון גרעיני לוקליזציה אותות (שקל)⁴^,⁵^,⁶ נחקר באופן נרחב. אולם, על מנת להפחית תופעות לוואי לא רצויות, ייתכן השליטה רוברטסונית גרעיני הוא הכרחי.

בעבר, מבוססות אור טרנסלוקציה של חלבונים לתוך גרעין התא הושגה באמצעות בכלובים NLS⁷^,⁸^,⁹. NLS נודד אל תוך גרעין התא על-ידי איגוד התחבורה cytoplasmic חלבונים⁶. בשיטות שדווחה, חלבונים חוות הנושאת NLS בכלובים ישירות שולבו הציטופלסמה מאת microinjection⁸ או לידי ביטוי תאי היעד באמצעות טכניקה הרחבה⁹הקוד הגנטי. לכן, שיטה להשגת ספיגת הסלולר והן צילום-induced רוברטסונית גרעינית היא יתרון עבור יישומים מעשיים.

במסמך זה, אנו מתארים מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים בתאים חיים באמצעות תגי דנדריטים דבק מולקולרית בכלובים (^כלואהדבק-R, איור 1). דבקים מולקולרית מסיסים במים¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ הנושאת תליונים גו⁺ מרובים בעבר פותחו, אשר באופן הדוק לדבוק חלבונים¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷, חומצות גרעין¹⁸^,¹⁹^,²⁰, פוספוליפיד ממברנות²¹, ו קליי nanosheets²²^,²³ דרך היווצרות גשרים מלח מרובים בין תליונים גו⁺ oxyanionic קבוצות על המטרות. ג. א.⁺ תליונים של ^כלואהדבק-R מוגנים על-ידי קבוצת anionic photocleavable, nitroveratryloxycarbonyl butyrate שהוחלפו (^BANVOC). האורחים המתויגת ^כלואהדבק-R נלקחים לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה והישאר ב- endosomes (איור 2). על photoirradiation, קבוצות NVOC ^BA ^כלואהדבק-R מנותקים להניב תשואה של שברחה מכלוב מולקולרית דבק (^Uncagedדבק-R) תליונים גו⁺ מרובים, נושאת המאפשרת ואז ההעברה של האורח מתויג לתוך הציטופלסמה ואחריו גרעין התא (איור 2). התג דבק-R ^כלואהניתן שברחה מכלוב על ידי חשיפה UV או שני הפוטונים-סגול (ניר) אור בלי phototoxicity רצינית. נדגים את המשלוח גרעיני מבוקר spatiotemporally של האורחים macromolecular, כמו גם מולקולה קטנה לאורחים תגים דבק-R ^כלואה, באמצעות נקודות קוונטיות (QDs) של הפלורסנט (nitrobenzoxadiazole; להארכה), בהתאמה, כדוגמאות.

איור 1: מבנה סכמטי של ^כלואהדבק-R. תליונים יון (ג. א.⁺) guanidinium 9 של ^כלואהדבק-R מוגן על ידי קבוצת nitroveratryloxycarbonyl butyrate שהוחלפו (^BANVOC). הקבוצות NVOC ^BAהם ביקע על ידי הקרנה UV או אור ניר שני הפוטונים. ליבת מוקד ^כלואהדבק-R הוא functionalized עם nitrobenzoxadiazole (להארכה) או dibenzocylooctyne (DBCO). הודפס מחדש באישור הפניה²⁰. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: איור סכמטי של מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים מצומדת עם תג דבק-R ^כלואה. האורח /^כלואהדבק-R המספר המשלים הוא נלקח לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה. בעת photoirradiation, התג דבק-R ^כלואההינם שברחה מכלוב להניב תג דבק-R ^Uncaged, דבר היכול להקל על הבריחה endosomal של האורח מתויגות. לאחר מכן, האורח מתויג נודד אל תוך גרעין התא. הודפס מחדש באישור הפניה²⁰. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

1. הכנת לאורחים עם דבק-R בכלובתגי להכין פתרון דבק-להארכה כלואה. לסנתז כלואהדבק-להארכה (איור 1) בעקבות הליכים שתואר לעיל20. להכין פתרון מניות של כלואהדבק-להארכה (10 מ מ) ביבש דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).הערה: אחסן את ה…

Representative Results

לפני photoirradiation, תאים Hep3B מודגרות עם דבק כלואה-להארכה הציג פליטת קרינה פלואורסצנטית punctate מן הפנים שלהם (λext = 488 ננומטר; דמויות 4A ו- 4 Cירוק). Micrograph מקביל הושג על עירור-543 nm לצבע אדום-פלורסנט (דמויות 4B ו- 4 C, אדום), המצי…

Discussion

חקירות קודמות מבוססות אור טרנסלוקציה של חלבונים לתוך גרעין התא הושגו באמצעות בכלובים NLS⁷^,⁸^,⁹. כאמור, שיטות אלה דורשים שיטות נוספות כדי לשלב את החלבונים מתויג NLS בתוך הציטופלסמה. לעומת זאת, התגים דבק-R שלנו ^כלואהמאפשרת לא רק תמונה-induced ר?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו להכיר את המרכז לשילוב NanoBio, באוניברסיטת טוקיו. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדענים (B) (26810046) כדי לעלף ו חלקית נתמך על ידי מענק הסיוע למחקר מיוחד קידום (25000005) חומרי גלם עוזר ההוראה תודה מלגות של יפן אגודת המחקר עבור קידום המדע (JSPS ) עבור מדענים צעירים ואת התוכנית עבור המובילים בוגרת בתי ספר (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimie. 48, 6571-6584 (2009).
Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).