Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Rina Mogaki; Kou Okuro; Akio Arisaka; Takuzo Aida

doi:10.3791/58631

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chimie

Spatiotemporally Photoactivatable etiketleri kafesli moleküler tutkallar kullanılarak canlı hücreler Konuk nükleer Translocation kontrollü

Published: January 17, 2019

doi:

10.3791/58631

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Bu iletişim kuralı ışık tetiklemeli nükleer translocation kafesli moleküler tutkal Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici.

Abstract

Hücre çekirdeği en önemli organellerin hücre altı ilaç dağıtım hedefi farklı gen çoğaltma modülasyon beri biridir ve ifade çeşitli hastalıkların tedavisinde etkilidir. Burada, biz ışık tetiklemeli nükleer translocation kullanarak Konuk moleküler tutkal (^kafeslitutkal-R) Etiketler olan birden çok guanidinium iyon (Gu⁺) kolyeler anyonik photocleavable grupla (bütrat yerine korunur, Kafesli göstermek nitroveratryloxycarbonyl; ^BA NVOC). ^Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar kapladığı yaşam içine endositoz ile hücre ve endosomes içinde kalır. Ancak, photoirradiation, ^kafeslitutkal-R endosomal kaçış ve konukların sonraki nükleer translocation kolaylaştırır birden çok Gu⁺kolye, taşıyan kokulum moleküler tutkal (^Uncagedtutkal-R) dönüştürülür. Tagged konuklar hücre çekirdeği tarafından takip sitoplazma içine geçirebilirsiniz bu yana bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici sadece photoirradiated. ^Kafesli Tutkal-R Etiketler kuantum nokta (QDs) gibi makromoleküllerin Konuklar küçük molekül konuklar yanı sıra teslim edebilirsiniz. ^Kafesli Tutkal-R Etiketler sadece UV ışık aynı zamanda derin doku nüfuz edebilir iki fotonlu yakın kızılötesi (Nur) ışık ile kokulum olabilir.

Introduction

Genetik bilgi taşıyan, hücre çekirdeği en önemli organellerin hücre altı ilaç dağıtım hedefi farklı gen çoğaltma modülasyon beri biridir ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisinde etkili ve genetik ifadesidir ¹^,²^,³bozuklukları. Gibi nükleer yerelleştirme sinyalleri (NLS)⁴^,⁵^,⁶ yaygın olarak araştırılması için nükleer teslimat ilaçların peptid konjugasyon Etiketler. Ancak, istenmeyen yan etkileri azaltmak için nükleer translocation kronolojik zamanmekansal kontrolü gereklidir.

Daha önce ışık tetiklemeli translocation proteinlerin hücre çekirdeği içine kafesli NLS⁷^,⁸^,⁹kullanılarak elde edilmiştir. NLS içine hücre çekirdeği sitoplazmik taşıma proteinleri⁶bağlama yaparak geçirir. Bildirilen yöntemlerde kafesli NLS taşıyan Konuk proteinler doğrudan mikroenjeksiyon⁸ tarafından sitoplazma dahil veya genetik kod genişleme teknik⁹kullanarak hedef hücrelerde dile getirdi. Bu nedenle, hücresel alımı ve nükleer translocation fotoğraf kaynaklı elde edebilirsiniz bir yöntem pratik uygulamalar için avantajlıdır.

Burada, nükleer translocation ışık tetiklemeli dendritik kafesli moleküler tutkal (^kafeslitutkal-R, Şekil 1) Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Suda çözünen moleküler tutkallar¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, birden çok Gu⁺ kolye taşıyan ²³ daha önce hangi sıkıca proteinler¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,–¹⁵^{uygun geliştirilmiştir,} ¹⁶^,¹⁷, nükleik asitler¹⁸^,¹⁹^,²⁰, fosfolipid membranlar²¹ve kil nanosheets²²^,²³ üzerinden Gu⁺ kolye ve oxyanionic gruplarını temel hedefleri arasında birden fazla tuz köprüleri oluşumu. ^Kafeslitutkal-R Gu⁺ kolye bir anyonik photocleavable grup bütrat yerine nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) tarafından korunmaktadır. ^Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar kapladığı yaşam içine hücreleri ile endositoz’ve konaklama endosomes (Şekil 2). Photoirradiation, ^kafeslitutkal-R ^BANVOC grupları öğesini Konuk göç kolaylaştıran birden çok Gu⁺ kolye, taşıyan bir kokulum moleküler tutkal (^Uncagedtutkal-R) vermeye ayrılır hücre çekirdeği (Şekil 2) tarafından takip sitoplazma. ^Kafeslitutkal-R etiket UV veya iki fotonlu yakın kızılötesi (Nur) ışık ciddi fototoksisite olmadan maruz kokulum olabilir. Biz spatiotemporally kontrollü nükleer teslimat makromoleküllerin konuklar hem de kuantum nokta (QDs) ve floresan boya (nitrobenzoxadiazole; kullanarak küçük molekül konuklar ^kafeslitutkal-R etiketlerle göstermek NBD), sırasıyla, örnek olarak.

Resim 1: Şematik yapıları ^kafeslitutkal-r. 9 guanidinium iyon (Gu⁺) kolyeler ^kafeslitutkal-r bütrat yerine nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) grubu tarafından korunmaktadır. ^BANVOC grupları ile UV veya iki fotonlu nur ışık tarafından i ciddi. ^Kafeslitutkal-R odak özünü nitrobenzoxadiazole (NBD) veya dibenzocylooctyne (DBCO) ile functionalized. Başvuru²⁰izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: Işık tetiklemeli nükleer translocation Konuk şematik gösterimi Birleşik bir ^kafeslitutkal-R etiketiyle. Konuk /^kafeslitutkal-R eşlenik yaşam içine alınır endositoz ile hücre. Photoirradiation, ^kafeslitutkal-R endosomal kaçış tagged Konuk kolaylaştırabilir bir ^Uncagedtutkal-R etiketi verim kokulum etikettir. Daha sonra tagged Konuk hücre çekirdeği geçirir. Başvuru²⁰izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protocol

1. hazırlanması konuklar kafeslitutkal-R ile Etiketler Kafeslitutkal-NBD çözüm hazırlamak. Kafeslitutkal-NBD (Şekil 1) aşağıdaki yordamlar yukarıda açıklanan20sentez. Kafeslitutkal-NBD (10 mM) Kuru dimetil sülfoksit (DMSO) içinde stok çözeltisi hazırlamak.Not: stok çözüm karanlıkta saklamak. Çözüm sulu arabellekleri veya hücre kültür medya kullanımı üzerine ile …

Representative Results

Photoirradiation önce onların iç punctate floresan emisyon kafeslitutkal-NBD ile inkübe Hep3B hücreleri sergilenen (λext 488 = nm; Rakamlar 4A ve 4 C, yeşil). Benzer bir test uyarma, 543 üzerine elde edildi kafeslitutkal-NBD endosomes içinde lokalize gösteren nm kırmızı-floresan boya (rakamlar 4B ve 4 C, kırmızı). Buna göre floresans emisyon <sup…

Discussion

Önceki araştırmalar, ışık tetiklemeli translocation proteinlerin hücre çekirdeği içine kafesli NLS⁷^,⁸^,⁹kullanılarak elde edilmiştir. Daha önce belirtildiği gibi bu yöntemler NLS öğesini proteinler sitoplazma dahil etmek için ek teknikler gerektirir. Buna ek olarak, bizim ^kafeslitutkal-R etiketi sadece nükleer translocation fotoğraf kaynaklı aynı zamanda misafir hücresel alımını sağlar. Bu ö…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NanoBio entegrasyonu için Tokyo Üniversitesi Merkezi anıyoruz. Bu eser için genç bilim adamları (B) (26810046) K.O. Grant-in-Aid tarafından desteklenen ve Grant-in-Aid tarafından özel olarak terfi için araştırma (25000005) ta RM sayesinde araştırma bursu Japonya Derneği promosyon, bilim (JSP’ler için kısmen destekleniyor ) genç bilim adamları ve önde gelen Enstitüler (GPLLI) için Program için.

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimie. 48, 6571-6584 (2009).
Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).