Détection du monoxyde d’azote dans le sang en mesurant Phosphorylation VASP plaquettaire
Summary
Nous présentons ici un protocole pour répondre à l’utilisation potentielle des plaquettes comme un capteur très sensible l’oxyde nitrique dans le sang. Il décrit la préparation de plaquettes initial et l’utilisation des nitrites et de cellules rouges du sang désoxygénés comme générateurs de l’oxyde nitrique.
Abstract
Les plaquettes sont les responsables de la coagulation sanguine correcte des composants sanguins. Leur fonction est fortement réglementée par diverses voies. Un des plus puissants agents vasoactifs, oxyde nitrique (NO), peut aussi agir comme un puissant inhibiteur de l’agrégation plaquettaire. Direct, aucun détection dans le sang n’est très difficile en raison de sa forte réactivité avec hémoglobine acellulaire qui ne limite aucun Half-Life à la gamme de milliseconde. Actuellement, aucun changement après que des interventions sont estimées uniquement ne basée sur les changements mesurés de nitrite et de nitrate (membres de la voie métabolique nitrate-nitrite-pas). Précise toutefois, ces mesures sont assez difficiles à n’interpréter par rapport aux réelles aucune modification, en raison de la nitrite de base élevées naturellement et concentrations qui sont de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que des changements attendus pas elle-même de nitrates. Par conséquent, le développement de méthodes simples et directs qui permettraient de détecter directement les N° est depuis longtemps. Ce protocole vise une utilisation potentielle des plaquettes comme une très sensible sans capteur dans le sang. Elle qualifie plasma riche en plaquettes initial (PRP) et préparations des plaquettes lavées et l’utilisation des nitrites et de cellules rouges du sang désoxygénés de pas générateurs. La phosphorylation de la VASP à sérine 239 (P-VASPSer239) est utilisée pour détecter la présence de no Le fait que la protéine VASP est fortement exprimée dans les plaquettes et qu’il est phosphorylé rapidement lorsqu’il est présent conduit à une occasion unique d’utiliser cette voie pour ne détecter directement aucune présence dans le sang.
Introduction
Les plaquettes sont des fragments de petites cellules discoïdes dérivés de mégacaryocytes qui sont cruciaux pour la coagulation du sang. La cascade de coagulation est initiée par diverses molécules bioactives (comme le collagène ou ADP), publiés après la blessure de la paroi vasculaire. La processus de coagulation peut être modifiée, parmi divers effecteurs de l’oxyde nitrique (NO). Non, produite naturellement par les cellules de mammifères, est l’un des signaux physiologiques plus polyvalents. Il agit comme un puissant vasodilatateur, le neurotransmetteur et le modulateur immunitaire, pour n’en nommer que quelques-uns de ses nombreuses fonctions. Dans la circulation sanguine, donc aussi aide à réguler l’étendue de la coagulation sanguine en inhibant l’agrégation plaquettaire. Une des sources plus probables du NO dans la circulation sanguine est nitrite, un ion inorganique qui a été établi pour servir de précurseur de no Réagissant avec les globules rouges (hématies), nitrite est réduit à N° et deoxyHb est oxydé en méthémoglobine (metHb)1. N° libéré des globules rouges est vasomoteur et provoque la vasorelaxation2. Cette voie de réduction de nitrite n’est un autre aucune voie de génération, agissant conjointement avec et en ne complétant la classique aucun chemin de génération par endothélial d’oxyde nitrique synthase, à des conditions d’hypoxie.
Les plaquettes eux-mêmes ne sont pas en mesure de réduire le nitrite en NO mais sont très sensibles à sa présence. Dans les plaquettes intactes, non dans le nanomolaires gamme augmente cGMP (EC50 = 10 nM) et la phosphorylation de VASP (EC50 = 0,5 nM)3. Dès lors, les plaquettes peuvent servir comme un excellent capteur de réduction des nitrites par les globules rouges et aucun rejet dans le sang. Il existe plusieurs méthodes permettant de mesurer directement la mesure de l’activation plaquettaire – tels qu’aggregometry et thromboélastographie (TEG)4,5. Cependant, ces méthodes nécessitent des instruments spécialisés coûteux et assez grandes quantités de matériel. Il est également possible de surveiller les événements en aval, après on ne se détache de globules rouges, en utilisant les changements dans l’expression de la protéine de surface plaquettaire – comme la P-sélectine6. N’est également connu pour augmenter la quantité de GMPC dans les plaquettes7. Auparavant, nous avons utilisé des cGMP pour ne suivre aucun rejet dans le sang après réduction des nitrites par désoxygéné RBC8. Cela s’est avéré pour être une méthode très sensible ; Cependant, cGMP est une molécule de courte durée et sa détection implique une vaste main de œuvre. Une autre possibilité, décrite dans le protocole présenté, utilise la phosphorylation de la phospho stimulée par vasodilatateur (VASP)-protéine pour détecter la présence de NO dans le sang. VASP est un substrat de l’activation de protéine kinase G, qui est phosphorylé lors de l’interaction avec les N° à la voie CGT/GMPC9. Détectable phosphorylation VASP se produit à très faible NO concentrations, ce qui pourraient faire de plaquettes un détecteur très sensible d’aucune présence dans le sang. VASP est fortement exprimée dans les plaquettes, mais pas dans les autres cellules sanguines, qui permet de suivre sélectivement les événements impliquant les plaquettes10.
Le principal objectif du présent protocole est de décrire la méthode dans le détail pour la détection d’aucune libération dans le sang entier à l’aide de son interaction avec les plaquettes en surveillant VASP phosphorylation11,12. La méthode décrite ne permet la détection précoce de faible aucune concentration – théoriquement dans la gamme nanomolar qui rend le présent protocole plus sensible que la détermination de cGMP, en raison de l’utilisation de techniques de transfert Western standard réalisables dans la plupart de laboratoire Paramètres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étant donné que les plaquettes sont facilement activées, douce manipulation plaquettes contenant des échantillons est nécessaire. Rapide de pipetage et secouant vigoureux doivent être évités. Plaquettaires tels que de la prostacycline (PGI2) peuvent être utilisés pour prévenir l’activation des plaquettes ; Toutefois, cela pourrait affecter certaines voies de signalisation à l’intérieur des plaquettes. Pour la préparation de boulettes de plaquettes, nous ajouter ACD pour les suspensions de pl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par bourse intra-muros NIH au Dr Alan N. Schechter.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
