Обнаружение на основе тромбоцитов оксида азота в крови путем измерения VASP фосфорилирование
Summary
Здесь мы представляем протокол для удовлетворения потенциального использования тромбоцитов как датчик высокочувствительный оксида азота в крови. Он описывает подготовку первоначальных тромбоцитов и использование нитрита и венозная красные кровяные клетки как оксид азота генераторов.
Abstract
Тромбоциты являются крови компонентов, отвечающих за надлежащее крови свертываясь. Их функция высоко регулируется различными путями. Один из самых мощных вазоактивных агентов, оксид азота (NO), также могут служить мощным ингибитором агрегации тромбоцитов. Прямые без обнаружения в крови является весьма сложной задачей из-за его высокую реакционную способность с свободной ячейки гемоглобина, который ограничивает не half-life в ряд миллисекунды. В настоящее время никаких изменений после вмешательства только оцениваются на основе измеренных изменений нитритов и нитратов (члены метаболический путь Нитрат нитрит нет). Однако, эти измерения точны достаточно сложно интерпретировать визави фактической никаких изменений, благодаря естественно высокий базовый нитритов и нитратов уровней, которые являются несколько порядков выше, чем ожидаемые изменения не сама по себе. Таким образом развитие прямых и простые методы, позволяющие определять NO непосредственно назрела давно. Этот протокол рассматриваются возможности использования тромбоцитов как высокочувствительный не датчик в крови. Он описывает первоначальный тромбоцитов богатой плазмы (PRP) и промывают тромбоцитов подготовка и использование нитрита и венозная красные кровяные клетки как нет генераторов. Фосфорилирование VASP на Серин 239 (Ser239P-VASP) используется для обнаружения присутствия № Тот факт, что белок VASP высоко выражается в тромбоцитах и что он быстро фосфорилированных когда NO присутствует приводит к уникальную возможность использовать этот путь непосредственно не обнаружение в крови.
Introduction
Тромбоциты являются фрагменты небольшие дискообразный клеток, производный от megakaryocytes, которые имеют решающее значение для свертывания крови. Каскад свертывания инициируется различных биоактивных молекул (например, коллаген или ADP), выпущенные после повреждения сосудистой стенки. Процесс свертывания крови могут быть изменены, среди различных эффекторов, оксида азота (NO). НЕТ, естественным образом вырабатывается клетками млекопитающих, является одним из самых разносторонних физиологических сигналов. Он действует как мощным сосудорасширяющим, нейромедиаторов и иммунного модулятора, чтобы назвать несколько из его многочисленных функций. В кровь нет также помогает регулировать степень свертывания крови, препятствует агрегации тромбоцитов. Одним из наиболее вероятные источники NO в крови является нитрит, неорганических ионов, что было показано, чтобы служить в качестве прекурсора № Реагирующих с красных кровяных телец (эритроцитов), нитрит сводится к NO и deoxyHb окисляется до метгемоглобина (metHb)1. НЕТ, освобождены от RBCs вазоактивное и вызывает покровов2. Этот путь сокращения нитрит-альтернативный путь не поколения, действуя вместе с и дополнения классической путь не поколения синтаза эндотелиального оксида азота в гипоксических условиях.
Тромбоциты, сами не способны уменьшить нитритов в NO, но очень чувствительны к ее присутствию. В нетронутыми тромбоцитов, не в наномолярных диапазона увеличивает cGMP (EC50 = 10 Нм) и фосфорилирование VASP (EC50 = 0,5 Нм)3. Таким образом тромбоцитов может служить отличным датчик нитрита сокращения эритроцитов и не выброса в кровь. Существует несколько методов, которые могут непосредственно измерить степень активации тромбоцитов – как aggregometry и тромбоэластография (ГТЭ)4,5. Однако эти методы требуют дорогих специализированных приборов и довольно большое количество материала. Это также возможно для мониторинга событий вниз по течению, после не освобождается от RBCs, используя изменения экспрессии белка поверхности тромбоцитов – например P селектина6. НЕТ также известен для увеличения количества cGMP в тромбоцитов7. Ранее мы использовали cGMP для мониторинга без выброса в кровь после сокращения нитрита венозная РБК8. Это оказалось очень чувствительным методом; Однако цГМФ является молекула недолго и его обнаружение включает в себя обширные труда. Другая возможность, описано в протоколе представленных использует фосфорилирование сосудорасширяющим стимулирует фосфористой (VASP)-белок для обнаружения присутствия No в крови. VASP является субстрат протеин киназы протеина G активации, который фосфорилированных после взаимодействия с NO через sGC/cGMP путь9. Обнаружению VASP фосфорилирования происходит без каких-либо очень низкой концентрации, которые могут сделать очень чувствительной детектор не присутствие тромбоцитов в крови. VASP высоко выражается в тромбоцитах, но не в других клеток крови, который позволяет выборочно следить за событиями, с участием тромбоциты10.
Основная цель настоящего Протокола заключается в описания метод детально для обнаружения не выпуска в цельной крови, с помощью его взаимодействия с тромбоцитов, мониторинг VASP фосфорилирование11,12. Описан метод позволяет раннего обнаружения низкого не концентрации – теоретически в наномолярных диапазоне, что делает настоящий протокол более чувствительны, чем определение цГМФ за счет использования стандартной западной помарки методы достижимыми в большинстве лаборатории Параметры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Так как тромбоциты активируются легко, щадящая обработка тромбоцитов, содержащего образцы не требуется. Следует избегать быстро закупорить и энергичные встряхивания. Тромбоцитов ингибиторы, такие как простациклин (PGI2) может использоваться для предотвращения активации тромбоци…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась интрамуральных гранта NIH д-р Алан н. Шехтер.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
