척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여
Summary
마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.
Abstract
Quantitating 그들의 의도 된 단백질 목표와 작은 분자의 상호 작용 하는 것이 신약 개발, 대상 유효성 검사 및 화학 프로브 유효성 검사에 대 한 중요 합니다. 단백질 대상 또는 작은 분자의 수정 없이이 현상을 측정 하는 메서드는 기술적으로 도전 하지만 특히 가치가 있습니다. 세포 열 교대 분석 실험 (CETSA)은 살아있는 세포에서 대상 참여 모니터링 하 한 기술입니다. 여기, 우리는 단일 세포 수준에서 subcellular 지 방화를 유지 하면서 높은 처리량 측정을 위한 수 있는 원래 CETSA 프로토콜의 적응을 설명 합니다. 우리는이 프로토콜 제공 세포의 유형이 다른 인구에서 특히 화합물 대상 상호 작용의 깊이 특성에 대 한 CETSA의 응용 프로그램에 중요 한 진보를 믿습니다.
Introduction
때 개발 하는 새로운 약물 또는 화학 프로브 측정 대상 인 또는 약혼 라이브 셀1,2,3의 관찰 된 약리 효과 또는 기능 판독 하 필수적 이다. 이러한 데이터는 작은 분자는 실제로 원하는 목표에 도달할 수 있도록 고 단백질 대상 선택4,5뒤에 생물 학적 가설을 확인 하기 위해 필요. 또한, 약물 개발 동안 증가 복잡성의 모델 시스템을 선택 하 여 확증 임상 시험 전에 복합 리드 사용 됩니다. 이러한 전 임상 시스템 생물학의 번역을 확인, 추적 마약 대상 참여와 함께이 개발 과정을 통해 생물학에 대 한 메서드는 중요 합니다.
마약-대상 참여 도전 unfunctionalized 작은 분자와 단백질, 특히 공간적 해상도6,7단일 세포 수준에서 라이브 셀에서 모니터링 하 전통적으로. 간의 상호 작용을 관찰 하는 최근 방법은 수정 되지 않은 약물 및 살아있는 세포에 있는 단백질은 세포 열 변화 분석 결과 (CETSA)는 열 도전 하 응답에서 네이티브 단백질의 ligand 유도 안정화는 정량된8, 9,10. 이것은 열 문제에 노출 된 후 남아 있는 수용 성 단백질을 측정 함으로써 이루어집니다. CETSA의 초기 공개, 서쪽 오 점 검출을 위해 사용 되었다. 심사 캠페인을 활성화 하 고 더 큰 복합 컬렉션의 심사 했다, CETSA 실험의 처리량을 증가 노력 여러 동종, microplate 기반 분석10,11의 개발을 리드를 해야 합니다. 그러나, 이러한 방법 한 가지 한계는 셀 정지에 복합 치료에 현재 가장 적합 한 하며 탐지 세포 세포의 용 해, 공간 정보의 손실에 지도 이다. CETSA 일 수 있다 실험적으로 열 집계 온도 (Tagg) ligand 유도 된 변화에 적용 작은 분자의 단일 농도 또는 ligand 농도 단일 온도에서 단백질을 안정화 하는 데 필요한. 후자은 등온선 복용량 응답 지문 (ITDRF) 이러한 측정 특정 실험 조건에의 의존을 불린다.
이 프로토콜의 목표 대상 약혼이 콘텐츠 현미경12immunofluorescent (IF) 항 체 검출에 의해 부착 셀에 CETSA를 사용 하 여 측정 하는입니다. 이 절차는 subcellular 지 방화의 절약 대상 포용의 단일 셀 정량화에 대 한 허용 하도록 원래 CETSA 플랫폼을 확장 합니다. 특히, 많은 이전 보고서와 달리이 절차에서 복합 치료 수행 됩니다 라이브 부착 세포 표면 분리 또는 열 도전, 따라서 우리가13를 측정 하는 것을 목표로 설립 된 바인딩 균형을 보존 하기 전에 세척 하지 않고. 현재 메서드는 유효성을 검사 한 대상 단백질 p38α에 대 한 (MAPK14)에 여러 셀 라인, 그리고 우리는이 절차를 공유 함으로써 기술 적용 광범위 하 게 녹는 프로테옴 바랍니다. 우리는이 프로토콜 검사에서 약물 개발 파이프라인에 걸쳐 적용할 수 있습니다, 대상 참여에서 vivo에서의 모니터링을 통해 심사 히트 예상.
Protocol
Representative Results
Discussion
결과 섹션에서 설명 했 듯이, 절차를 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 그것은 높은-품질 선호도 시 약을 식별 하는 것이 중요입니다. 각 원하는 대상에 대 한 항 체의 작은 도서관을 심사 하는 것이 좋습니다. 1 차적인 항 체를 선택한 후 적절 한 단백질 대상의 다른 바인딩 사이트의 숫자에 대 한 시스템의 유효성을 검사 하는 것이 중요 이기도 합니다. 열 문제를 생략 하 여 그?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 과학 생활 연구소와 카롤 린스 카 Institutet 위한 인프라 지원을 인정합니다. 저자는 또한 입력과 Michaela Vallin, 막달레나 Otrocka와 토마스 Lundbäck 토론을 인정합니다.
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
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