Kromatin Immunoprecipitation av murina Brun fettvävnad
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för effektiv kromatin immunoprecipitation (ChIP) följt av hög genomströmning DNA-sekvensering (ChIP-seq) av Brun fettvävnad (BAT) isolerad från en mus. Detta protokoll är lämplig för både kartläggning Histon ändringar och utreda genome-wide lokalisering av icke-histonglykoprotein proteiner av intresse i vivo.
Abstract
Den cellulära processer regleras av transkriptionell modulering av specifik gen program. Sådan modulering uppnås genom de kombinerade åtgärderna av ett brett utbud av transkriptionsfaktorer (TFs) och kofaktorer medla transkriptionell aktivering eller förtryck via förändringar i kromatinstrukturen. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en användbar molekylärbiologi metod för mappning Histon ändringar och profilering transkription faktorer/kofaktorer bindning till DNA, vilket ger en ögonblicksbild av de dynamiska nukleära ändringar som inträffar under olika biologiska processer.
För att studera Transkriptionsreglering i fettvävnad, prover från in vitro- cellkulturer av förevigade eller primär cell linjer ofta gynnas i ChIP analyser på grund av överflödet av utgångsmaterial och reducerade biologiska variationen. Dessa modeller utgör dock en begränsad ögonblicksbild av tillståndet faktiska kromatin i levande organismer. Således finns det ett kritiskt behov för optimerade protokoll att utföra ChIP på fettvävnad prover från djurmodeller.
Här beskriver vi ett protokoll för effektiv ChIP-seq både Histon ändringar och icke-histonglykoprotein proteiner i Brun fettvävnad (BAT) isolerad från en mus. Protokollet är optimerad för att utreda genome-wide lokalisering av proteiner av intresse och epigenetiska markörer i BAT, som är ett morfologiskt och fysiologiskt olika vävnad bland fett depåer.
Introduction
Medan vit fettväv (WAT) är specialiserad för energilagring, avleder Brun fettvävnad (BAT) energi i form av värme på grund av dess förmåga att omvandla kolhydrater och lipider till värmeenergi via mitokondriell uncoupling1. På grund av denna specialiserade funktion krävs BAT depån för underhåll av kroppstemperatur i fysiologiska förhållanden och i svar på kalla exponering. Medan gen uttryck förändringar under BAT differentiering och vid termogena stress har studerats in vivo och in vitro-, har de molekylära mekanismerna bakom dessa förändringar varit mestadels dissekeras i förevigade cellinjer och primära före adipocyter, med undantag för flera studier i2,3,4,5.
Reglering av specifik gen uttryck program via Transkriptionsreglering uppnås genom samordnade förändringar i kromatin struktur via olika transkription faktorer och samtidig faktorer åtgärder. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en värdefull molekylärbiologi tillvägagångssätt för att undersöka rekrytering av dessa faktorer till DNA och för profilering de tillhörande ändringarna i kromatin landskap. Nyckelfaktorer för framgång för ChIP experiment inkluderar optimeringar av crosslinking villkor och kromatin klippning konsekvens i hela olika prover, tillgången på lämpliga utgångsmaterial och, framför allt, kvalitet av antikroppar. När du utför ChIP från hela vävnader, det är också viktigt att överväga heterogenitet av proverna och optimera protokollet för att förbättra effektiviteten av atomkärnor isolering, med den senare är ett särskilt känsliga steg när du arbetar med fettvävnad på grund den förhöjda fetthalten. I själva verket molekylär isolering tekniker från hela fett depåer försvåras av närvaron av höga nivåer av triglycerider och protokoll måste vara optimerad för att öka mängden av kromatin isolering. Slutligen, när hög genomströmning sekvensering utförs efter ChIP-DNA isolering, sekvensering djupet är avgörande för att fastställa antalet toppar som upptäcks tryggt.
Här hänvisar vi till arbetsstandarder och allmänna riktlinjer för ChIP-seq experiment rekommenderas av koda och modENCODE konsortier6 för bästa praxis, och vi fokuserar på en stegvis beskrivning av ett protokoll som optimerats för ChIP-seq från BAT. Protokollet beskrivs möjliggör effektiv isolering av kromatin från fettvävnad att utföra genome-wide sekvensering av DNA-bindande faktorer med väldefinierade toppar samt Histon märken med mer diffusa signaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs här representerar ett värdefullt verktyg för att utföra ChIP från murina vävnader, särskilt optimerat för Brun fettvävnad. En av de största utmaningarna i utföra ChIP från vävnad återhämtar sig ett tillräckligt antal celler under provberedning. Klippning BAT med en vävnad Homogenisatorer mixer tillsammans med rostfritt stål pärlor istället för en kanonisk glas mortelstöt avsevärt minskar antalet celler som förloras på grund av obruten vävnad. Dessutom hjälper homogenisering…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- . Genome Browser Gateway Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- . Irreproducible Discovery Rate (IDR) Available from: https://github.com/nboley/idr (2018)
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
