هنا يمكننا وصف بروتوكول لكفاءة الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) تليها الفائق تسلسل الحمض النووي (الرقائق-seq) من الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. هذا البروتوكول مناسبة لكل رسم الخرائط هيستون التعديلات والتعريب على نطاق الجينوم من البروتينات غير هيستون لمصلحة فيفو فيالتحقيق.
وينظم عمليات الخلوية الأكثر النسخي تحوير الجينات محددة البرامج. ويتحقق هذا التعديل من خلال الإجراءات المشتركة لمجموعة واسعة من عوامل النسخ (TFs) والعوامل المساعدة في التوسط للتنشيط النسخي أو القمع عن طريق التغييرات في هيكل الكروماتين. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهج مفيدة في مجال بيولوجيا الجزيئية لرسم الخرائط التعديلات هيستون والتنميط النسخ العوامل/العوامل المساعدة ملزمة للحمض النووي، وبالتالي توفير لقطة من التغيرات النووية الدينامية التي تحدث خلال مختلف العمليات البيولوجية.
دراسة تنظيم النسخي في الأنسجة الدهنية والعينات المستمدة من الثقافات الخلايا في المختبر لتخليد أو خطوط الخلايا الأولية هي غالباً ما يفضل في رقاقة فحوصات بسبب وفرة ابتداء من المواد وتقليل التنوع البيولوجي. ومع ذلك، تمثل هذه النماذج لقطة محدودة للدولة الكروماتين الفعلية في الكائنات الحية. ومن ثم، هناك حاجة ماسة للبروتوكولات الأمثل لأداء رقاقة على عينات الأنسجة الدهنية المستمدة من النماذج الحيوانية.
هنا يصف لنا بروتوكول ل seq رقاقة كفاءة التعديلات هيستون والبروتينات غير هستون في الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. البروتوكول هو الأمثل للتحقيق في التعريب على نطاق الجينوم من البروتينات للفائدة وعلامات جينية في الخفافيش، التي مستقلة شكلياً وفسيولوجيا أنسجة بين مستودعات الدهون.
الأنسجة الدهنية براون (BAT) بينما الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) المتخصصة لتخزين الطاقة، تبدد الطاقة في شكل حرارة نظراً لقدرته على تحويل الكربوهيدرات والدهون إلى طاقة حرارية عن طريق يفصل المتقدرية1. بسبب هذه الوظيفة المتخصصة، ومستودع التقنيات المطلوبة للمحافظة على درجة حرارة الجسم في الظروف الفسيولوجية واستجابة للتعرض للبرد. في حين قد درست التغيرات التعبير الجيني أثناء تمايز الخفافيش وعند الإجهاد حرارة على نطاق واسع في الحية وفي المختبر، الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه التغيرات كانت معظمها تشريح في خطوط الخلايا مخلدة والابتدائي adipocytes المسبق، باستثناء عدة الدراسات المجراة في2،،،من34،5.
تنظيم برامج تعبير الجينات المحددة من خلال تنظيم النسخي يتحقق عن طريق التغييرات المنسقة في الكروماتين الهيكل عن طريق النسخ مختلف العوامل واشتركت عوامل الإجراءات. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهج قيمة بيولوجيا الجزيئية للتحقيق في توظيف هذه العوامل للحمض النووي والتنميط يرتبط بها من التغيرات في المناظر الطبيعية الكروماتين. وتشمل العوامل الرئيسية لنجاح تجارب رقاقة أمثل الظروف crosslinking واتساق القص الكروماتين في أنحاء مختلفة من العينات، توافر انطلاق المادية، والكافية، وأبرزها نوعية الأجسام المضادة. عند أداء رقاقة من الأنسجة كاملة، من المهم أيضا النظر في عدم تجانس العينات وتحسين البروتوكول تحسين كفاءة العزل النوى، ومع هذا الأخير يجري خطوة حساسة بشكل خاص عند العمل مع الأنسجة الدهنية نظراً محتوى الدهون مرتفعة. في الواقع، التقنيات الجزيئية العزلة من مستودعات كله الدهنية تتعقد بسبب وجود مستويات عالية من الدهون الثلاثية، وبروتوكولات يجب أن يكون الأمثل لزيادة مقدار عزل الكروماتين. وأخيراً، عندما يتم إجراء تسلسل الفائق بعد عزلة رقاقة الحمض النووي، عمق التسلسل أمر حاسم لتحديد عدد القمم التي يتم الكشف عنها بثقة.
هنا، نود أن نشير إلى أن معايير العمل والمبادئ التوجيهية العامة للتجارب رقاقة seq الذي أوصت به ترميز ومودينكودي اتحادات6 لأفضل الممارسات، ونحن نركز على وصف خطوة بخطوة لبروتوكول الأمثل ل seq رقاقة من الخفافيش. يسمح البروتوكول وصف لكفاءة عزل الكروماتين من الأنسجة الدهنية لإجراء تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة للحمض النووي–ربط العوامل مع قمم محددة تحديداً جيدا، فضلا عن علامات هستون بإشارات أكثر انتشارا.
ويمثل البروتوكول الموصوفة هنا هي أداة قيمة لأداء رقاقة من الأنسجة مورين، وعلى وجه التحديد الأمثل للنسيج الدهني البنى. واحدة من أكبر التحديات في أداء رقاقة من الأنسجة يتعافى بعدد كاف من الخلايا أثناء إعداد عينة. القص بات استخدام خلاط الخالطون أنسجة مقترنة بحبات الفولاذ المقاوم للصدأ بدلا?…
Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
HiSeq 2000 | Illumina |