Single-step purificazione di complessi macromolecolari usando RNA attaccato alla biotina e un Linker foto-spaccabili
Summary
Complessi RNA/proteici purificati mediante botin-streptavidina strategia sono eluiti per soluzione in condizioni denaturanti in forma inadatta per ulteriore purificazione e analisi funzionale. Qui, descriviamo una modifica di questa strategia che utilizza un linker foto-spaccabili in RNA e un delicato passaggio di UV-eluizione, producendo complessi RNA/proteine native e completamente funzionale.
Abstract
Per molti anni, eccezionalmente forte e rapidamente formato interazione biotina streptavidina è stata utilizzata con successo per purificazione parziale dei complessi RNA/proteine biologicamente importanti. Tuttavia, questa strategia soffre di uno dei principali svantaggi che limita il suo utilizzo più ampio: l’interazione biotina/streptavidina può essere rotto solo sotto denaturare condizioni che anche compromettere l’integrità dei complessi eluiti, quindi precludendo loro successive analisi funzionale e/o ulteriore purificazione da altri metodi. Inoltre, i campioni eluiti sono spesso contaminati con le proteine di sfondo che non specifico associano con streptavidina perline, che complica l’analisi dei complessi purificati dalla macchiatura d’argento e spettrometria di massa. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una variante della biotina/streptavidina strategia in cui biotina è collegata a un RNA substrato tramite un linker foto-spaccabili e i complessi immobilizzati su streptavidina perline sono eluiti selettivamente alla soluzione in un formato nativo di onda lunga UV, lasciando le proteine di sfondo sui branelli. Substrati di associazione più breve RNA possono essere sintetizzati chimicamente con biotina e il linker foto-spaccabili legame covalente all’estremità 5′ del RNA, mentre più substrati di RNA possono essere forniti con i due gruppi di un oligonucleotide complementare. Queste due varianti del metodo UV-eluizione sono state testate per la purificazione dei complessi elaborazione snRNP-dipendente U7 che fendono istone pre-mRNA all’estremità 3′ e hanno entrambi dimostrato di reggono il confronto ad altri precedentemente sviluppato metodi di purificazione. I campioni eluiti UV contengono quantità molto facilmente rilevabile delle snRNP U7 che era esente dagli agenti inquinanti principali proteine e adatto per l’analisi diretta di spettrometria di massa e saggi funzionali. Il metodo descritto può essere prontamente adattato per la purificazione di altri complessi di associazione di RNA e utilizzato in combinazione con siti di legame del DNA singolo – e double-stranded per purificare proteine DNA-specifico e complessi macromolecolari.
Introduction
Negli eucarioti, precursori di RNA polimerasi II-generato mRNA (pre-mRNA) sottoporsi a diversi eventi di maturazione nel nucleo prima di diventare pienamente funzionali modelli di mRNA per la sintesi proteica nel citoplasma. Uno di questi eventi è di processamento dell’estremità 3′. Per la stragrande maggioranza dei pre-mRNA, 3′ fine trattamento comporta clivaggio accoppiato di poliadenilazione. Questa reazione in due fasi è catalizzata da un complesso relativamente abbondante composto da più di 15 proteine1. Animale replica-dipendente dell’istone pre-mRNA vengono elaborati all’estremità 3′ da un meccanismo differente in cui il ruolo chiave è giocato da U7 snRNP, una scarsa abbondanza complesso composto da U7 snRNA di ~ 60 nucleotidi e più proteine2,3 . Le coppie di basi U7 snRNA con specifiche sequenze di istone pre-mRNA e uno delle subunità della snRNP U7 catalizza la reazione di scissione, generando maturo istone mRNA senza un poli (a) coda. 3′ terminare l’elaborazione di istone pre-mRNA richiede anche gambo-ciclo Binding Protein (SLBP), che associa un gambo-ciclo conservato situato a Monte del sito di clivaggio e migliora l’assunzione delle snRNP U7 al substrato2,3. Gli studi finalizzati ad individuare i singoli componenti delle snRNP U7 sono stati impegnativi a causa della bassa concentrazione delle snRNP U7 in cellule animali e la tendenza del complesso di dissociare o subiscono parziale proteolisi durante la purificazione come conseguenza dell’utilizzo detergenti delicati4,5,6, lavaggi sale alte e/o più passaggi cromatografici7,8,9.
Recentemente, per determinare la composizione dell’apparato di elaborazione U7-dipendente, un breve frammento di biotina contenenti pre-mRNA di istone 3′ o 5′ è stato incubato con un estratto nucleare e i complessi montati sono stati catturati su rivestite con streptavidina agarosio perline5,6,10. A causa di eccezionalmente forte interazione biotina streptavidina, proteine immobilizzate su streptavidina perline sono stati eluiti sotto condizioni di denaturazione bollendo in SDS e analizzati dalla macchiatura d’argento e spettrometria di massa. Mentre questo approccio semplice ha individuato una serie di componenti delle snRNP U7, ha reso relativamente grezzi campioni, spesso contaminati con un gran numero di proteine sfondo non specifico associato a perle di streptavidina, potenzialmente mascherare alcuni componenti di i macchinari di lavorazione e prevenire la loro rilevazione su argento macchiato gel5,6,10. D’importanza, questo approccio anche precluso qualsiasi studi funzionali con il materiale isolato e suo ulteriore purificazione per omogeneità di metodi aggiuntivi.
Sono state proposte una serie di modifiche nel tempo per affrontare la natura praticamente irreversibile dell’interazione biotina/streptavidina, con la maggior parte di loro essendo progettato per indebolire o l’interazione o per fornire un braccio spaziatore chimicamente spaccabili nella biotina-contenere i reagenti11,12. L’inconveniente di tutte queste modifiche era che riducono in modo significativo l’efficienza del metodo e/o condizioni di non-fisiologica spesso richieste durante la fase di eluizione, compromettere l’integrità o la attività delle proteine purificate.
Qui, descriviamo un approccio diverso per risolvere il problema inerente della strategia di biotina/streptavidina utilizzando RNA substrati in cui la biotina è covalente al 5′ estremità tramite una foto-spaccabili 1-(2-nitrofenil) frazione etilico che è sensibile alla lunghezza d’onda UV13,14. Abbiamo testato questo approccio per la purificazione dell’apparato di elaborazione limitante U7-dipendente dalla drosofila e mammiferi nucleari estratti15. Dopo una breve incubazione di biotina contenenti pre-mRNA di istone e il linker foto-spaccabili con un estratto nucleare, i complessi di elaborazione assemblati sono immobilizzati su perle di streptavidina, lavati accuratamente e delicatamente rilasciati alla soluzione in un nativo forma di esposizione a ~ 360 nm UV luce. Il metodo UV-eluizione è molto efficiente, veloce e semplice, producendo una quantità sufficiente delle snRNP U7 per visualizzare i componenti di scheggia colorazione da appena 100 µ l di Estratto di15. Il materiale UV-eluito è privo di proteine sfondo e adatto per analisi di spettrometria di massa diretto, fasi di purificazione supplementare e saggi enzimatici. Lo stesso metodo può essere adottato per la purificazione di altri complessi di RNA/proteine che richiedono relativamente brevi siti di legame di RNA. Biotina e il linker foto-spaccabili può anche essere in covalenza collegati al singolo – e double-stranded DNA, potenzialmente estendendo il metodo UV-eluizione per la depurazione di vari complessi di DNA/protein.
Sintesi chimica di substrati di RNA contenenti covalenza collegato biotina e il linker foto-spaccabili è pratico solo con le sequenze che non superano i nucleotidi ~ 65, diventando costoso e inefficiente per sequenze significativamente più lungo. Per risolvere questo problema, abbiamo anche sviluppato un metodo alternativo che è adatto per molto più tempo obiettivi vincolanti di RNA. In questo approccio, RNA di qualsiasi sequenza del nucleotide e lunghezza è generato in vitro di T7 e SP6 la trascrizione e ricotto per un breve oligonucleotide complementare che contiene biotina e il linker foto-spaccabili all’estremità 5′ (trans configurazione). Il duplex risultante viene successivamente utilizzato per purificare proteine leganti singoli o complessi macromolecolari su streptavidina perline seguendo lo stesso protocollo descritto per i substrati di RNA contenenti foto-spaccabili biotina associata covalentemente (cis configurazione). Con questa modifica, la biotina foto-spaccabili utilizzabile in combinazione con le trascrizioni in vitro generato contenente centinaia di nucleotidi, estendendo il metodo UV-eluizione per la purificazione di una vasta gamma di RNA/proteine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto è semplice e oltre che incorporano un foto-spaccabili linker e il passaggio di UV-eluizione non differisce dai metodi comunemente usati che sfruttano estremamente forte interazione biotina streptavidina. Il passaggio di UV-eluizione è molto efficiente, rilasciando in genere oltre il 75% del RNA immobilizzato e proteine da streptavidina perline, lasciando dietro di sé un elevato background di proteine che legano non specificamente ai talloni associate. Eliminando questo sfondo, il passo di UV-el…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i nostri colleghi e collaboratori per il loro contributo al nostro lavoro. Questo studio è stato sostenuto dal NIH concedere GM 29832.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
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