生物素和光裂解链接器所附 rna 对高分子配合物的单步纯化
Summary
采用肉毒分蛋白策略纯化的 rna* 蛋白复合物在变性条件下被洗脱, 以不适合进一步纯化和功能分析的形式进行溶液处理。在这里, 我们描述了这种策略的修改, 利用光裂解链接器在 rna 和温和的紫外线洗脱步骤, 产生本地和全功能的 rna 蛋白复合物。
Abstract
多年来, 生物素与链霉素之间异常强烈和快速形成的相互作用已被成功地用于生物重要 rna 蛋白复合物的部分纯化。然而, 这一战略有一个主要的缺点, 限制了其更广泛的利用: 生物素/链霉素相互作用只能在变性的条件下打破, 这也会破坏洗脱的复合物的完整性, 从而排除了它们的随后的功能分析和/或其他方法的进一步纯化。此外, 洗脱的样品经常被背景蛋白污染, 这些蛋白质与链霉素珠没有特别的联系, 使银染色和质谱分析对纯化的配合物的分析复杂化。为了克服这些限制, 我们开发了一种生物素/链霉素策略的变种, 在这种策略中, 生物素通过光裂解链接器附着在 rna 基板上, 而固定在链霉素微珠上的配合物被选择性地洗脱, 以溶液。原生形式由长波 uv, 留下的背景蛋白上的珠子。较短的 rna 结合底物可以用生物素和光裂解链剂共价地合成到 rna 的 5 ‘ 端, 而较长的 rna 底物可以通过互补的寡核苷酸与这两组一起提供。这两个变种的 uv 洗脱法的纯化纯化 u7 snnp 依赖的加工复合物, 在 3 ‘ 端切割组蛋白前 mrna, 他们都证明与其他以前开发的纯化方法相比是有利的。uv 洗脱样品含有易于检测的 u7 snrnp, 该样本不含主要蛋白质污染物, 适合通过质谱和功能分析进行直接分析。所述方法可很容易地用于纯化其他 rna 结合物, 并与单链和双链 dna 结合位点结合使用, 以纯化 dna 特异性蛋白质和大分子复合物。
Introduction
在真核生物中, rna 聚合酶 ii 生成的 mrna 前体 (预 mrna) 在成为细胞质中蛋白质合成的全功能 mrna 模板之前, 在细胞核中经历了几次成熟事件。其中一个事件是 3 ‘ 结束处理。对于绝大多数的前 mrna, 3 ‘ 的端部处理涉及裂解结合到多腺苷酸化。这种两步反应是由一个相对丰富的复合体催化的, 该复合物由15个以上的蛋白质1组成。动物复制依赖性组蛋白前 mrna 在 3 ‘ 端由 u7 snrnp 发挥关键作用的不同机制进行处理, u7 snrnp 是一种低丰度复合体, 由 ~ 60 核苷酸的 u7 snRNP 和多个蛋白质2,3组成。.u7 snrna 碱基对具有组蛋白前 mrna 中的特定序列, u7 snrnp 的一个亚基催化裂解反应, 在没有聚 (a) 尾的情况下产生成熟的组蛋白 mrna。3 ‘ 组蛋白前 mrna 的最终处理还需要 stem-loop 结合蛋白 (slbp), 它结合位于裂解部位上游的保守茎环, 并增强了 u7 snRNP 在基板 2,3中的招募。旨在确定 u7 snrnp 的各个成分的研究一直具有挑战性, 因为 u7 snrnp 在动物细胞中的浓度较低, 而且该复合体在纯化过程中倾向于分离或接受部分蛋白溶解, 因为使用温和的洗涤剂4,5,6, 高盐洗涤和/或多个色谱步骤7,8,9。
最近, 为了确定 u7 依赖加工机械的组成, 用核提取物孵育了含有 3 ‘ 或 5 ‘ 的含有生物素的组蛋白前 mrna 的短片段, 并在链球菌包层上捕获了组装的配合物琼脂糖珠5,6,10。由于生物素与链霉素之间的相互作用特别强, 在致密条件下, 通过在 sds 中沸腾, 将固定在链霉素上的蛋白质洗脱, 并进行银染色和质谱分析。虽然这种简单的方法确定了 u7 snrnp 的一些组成部分, 但它产生了相对粗糙的样本, 往往被大量与链霉素珠无关的背景蛋白污染, 有可能掩盖一些成分。加工机械, 防止其检测银染凝胶5,6,10.重要的是, 这种方法也排除了任何功能研究与分离的材料, 并进一步净化其均匀性的额外方法。
随着时间的推移, 提出了一些修改, 以解决生物素/链霉素相互作用几乎不可逆转的性质, 其中大多数是为了削弱相互作用, 或者在生物技术上提供可化学裂解的间隔臂。含有生物素的试剂11,12。所有这些修饰的缺点是, 它们显著降低了方法的效率, 或者在洗脱步骤中经常需要非生理条件, 从而危及纯化蛋白质的完整性或活性。
在这里, 我们描述了一种不同的方法来解决生物素/链霉素策略的固有问题, 使用 rna 底物,其中生物素通过光裂解 1-(2-硝基苯) 乙基体共价连接到 5 ‘ 端。对长波 uv13,14敏感。我们测试了这种方法, 以净化限制 u7依赖加工机械从果蝇和哺乳动物核提取物15。在对含有生物素的组蛋白前 mrna 和含有核提取物的光裂解链接剂进行短暂的培养后, 将组装好的加工配合物固定在链霉素珠上, 彻底清洗后, 轻轻释放到本地的溶液中通过暴露在 ~ 360 纳米紫外线照射下形成。uv 洗脱法是非常有效, 快速和直接, 产生足够数量的 u7 snrnp 可视化其成分的滑块染色从只有100μl 的提取物15。uv 洗脱材料不含背景蛋白, 适用于直接质谱分析、额外的纯化步骤和酶检测。同样的方法也可以用于纯化需要相对较短的 rna 结合位点的其他 rna·蛋白复合物。生物素和光裂解链接剂也可以共价地附着在单链和双链 dna 上, 有可能扩展紫外洗脱法, 用于纯化各种 dna/蛋白复合物。
含有共价附着生物素和光裂解链接剂的 rna 底物的化学合成, 只有在序列不超过 ~ 65 核苷酸的情况下才是可行的, 对于明显较长的序列来说, 这种合成变得昂贵且效率低下。为了解决这个问题, 我们还开发了一种替代方法, 适用于更长的 rna 结合目标。在这种方法中, 任何长度和核苷酸序列的 rna 都是由 t7 或 sp6 转录在体外生成的, 并在 5 ‘ 端退火为含有生物素和光裂解链接剂的短的互补寡核苷酸 (trans)配置)。由此产生的双相化随后被用来纯化链状粘胶珠上的单个结合蛋白或大分子复合物, 其方法与含有光裂解生物素的 rna 底物共价的 rna 底物相同的协议相同 (cis)。配置)。通过这种修饰, 可光斑裂解生物素可与含有数百核苷酸的体外生成的转录结合使用, 从而扩展了用于纯化范围广泛的 rn·蛋白的 uv 洗脱方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的方法很简单, 除了纳入光裂解链接器和 uv 洗脱步骤没有区别于常用的方法, 利用生物素和链霉素之间的极强的相互作用。uv 洗脱步骤是非常有效的, 通常释放75% 以上的固定化 rna 和相关的蛋白质从链霉素珠, 留下了一个高背景的蛋白质, 非专门结合到珠子。通过消除这种背景, uv 洗脱步骤产生了非常纯净的样品, 适用于银染色、质谱和功能分析的直接分析。
由于涉及?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢我们的同事和合作者对我们工作的贡献。这项研究得到了国家卫生研究院 gm 29832 的支持。
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d’Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3′ end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 ‘-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 ‘-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2′- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 ‘-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5′-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ‘ exonuclease that specifically interacts with the 3 ‘ end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3’hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3’hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3′ end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ‘ end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L’Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3′ end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
