बायोटिन से जुड़ी आरएनए का उपयोग करके Macromolecular परिसरों का एकल-चरण शुद्धिकरण और एक फोटो-सट linker
Summary
आरएनए/प्रोटीन परिसरों botin का उपयोग कर शुद्ध-streptavidin रणनीति आगे शोधन और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक अनुपयुक्त रूप में denaturing शर्तों के तहत समाधान के लिए eluted हैं । यहां, हम इस रणनीति का एक संशोधन है कि एक फोटो-आरएनए में सट linker और एक सज्जन यूवी-रेफरेंस कदम का इस्तेमाल, देशी और पूरी तरह कार्यात्मक आरएनए उपज/
Abstract
कई वर्षों के लिए, असाधारण मजबूत और तेजी से बायोटिन और streptavidin के बीच बातचीत का गठन सफलतापूर्वक जैविक रूप से महत्वपूर्ण आरएनए के आंशिक शुद्धि के लिए उपयोग किया गया है/ हालांकि, यह रणनीति एक प्रमुख नुकसान से ग्रस्त है कि अपने व्यापक उपयोग सीमा: बायोटिन/streptavidin बातचीत denaturing शर्तों के तहत ही तोड़ा जा सकता है कि eluted परिसरों की अखंडता को भी बाधित है, इसलिए precluding उनके बाद में कार्यात्मक विश्लेषण और/या अंय तरीकों से आगे शोधन । इसके अलावा, eluted नमूने अक्सर streptavidin मोतियों के साथ विशेष रूप से संबद्ध है कि पृष्ठभूमि प्रोटीन के साथ प्रदूषित कर रहे हैं, चांदी धुंधला और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा शुद्ध परिसरों के विश्लेषण उलझी । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम बायोटिन/streptavidin रणनीति है जिसमें बायोटिन एक आरएनए सब्सट्रेट करने के लिए एक तस्वीर के माध्यम से संलग्न है के एक संस्करण विकसित-सट linker और परिसरों streptavidin मोतियों पर मैटीरियल चुनिंदा एक में हल करने के लिए eluted हैं लंबी लहर यूवी द्वारा देशी फार्म, मोतियों पर पृष्ठभूमि प्रोटीन जा. छोटे शाही सेना के बंधन सब्सट्रेट एक पूरक oligonucleotide द्वारा दो समूहों के साथ प्रदान किया जा सकता है, जबकि अब आरएनए सब्सट्रेट, आरएनए के 5 ‘ अंत करने के लिए संलग्न फोटो-सट लिंकर covalently और बायोटिन के साथ रासायनिक संश्लेषित किया जा सकता है । यूवी रेफरेंस विधि के इन दो वेरिएंट U7 snRNP-निर्भर प्रसंस्करण परिसरों कि 3 ‘ अंत में हिस्टोन पूर्व mRNAs सट और वे दोनों दूसरे पहले से विकसित शुद्धि तरीकों के लिए अनुकूल तुलना करने के लिए साबित कर दिया के शोधन के लिए परीक्षण किया गया । यूवी eluted नमूने U7 snRNP कि प्रमुख प्रोटीन संदूषण और जन स्पेक्ट्रोमेट्री और कार्यात्मक परख द्वारा प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए उपयुक्त से मुक्त किया गया था की आसानी से पता लगाने की मात्रा में निहित । वर्णित विधि आसानी से अन्य आरएनए बाध्यकारी परिसरों की शुद्धि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और डीएनए विशिष्ट प्रोटीन और macromolecular परिसरों को शुद्ध करने के लिए एकल और डबल असहाय डीएनए बंधन साइटों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया.
Introduction
eukaryotes में, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय जनित mRNA पुरोगामी (pre-mRNAs) mRNA में प्रोटीन संश्लेषण के लिए पूरी तरह कार्यात्मक कोशिका द्रव्य टेम्पलेट्स बनने से पहले नाभिक में कई परिपक्वता घटनाओं से गुजरना । इन घटनाओं में से एक 3 ‘ अंत प्रसंस्करण है । पूर्व mRNAs, 3 ‘ अंत प्रसंस्करण के विशाल बहुमत के लिए polyadenylation के साथ मिलकर दरार शामिल है । यह दो कदम प्रतिक्रिया एक अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में 15 से अधिक प्रोटीन1से मिलकर जटिल द्वारा catalyzed है । पशु प्रतिकृति-निर्भर हिस्टोन पूर्व mRNAs एक अलग तंत्र जिसमें महत्वपूर्ण भूमिका U7 snRNP, एक कम बहुतायत के U7 snRNA से मिलकर जटिल द्वारा खेला जाता है द्वारा 3 ‘ अंत में संसाधित कर रहे है ~ ६० न्यूक्लियोटाइड और एकाधिक प्रोटीन2,3 . हिस्टोन प्री-mRNA में एक विशिष्ट अनुक्रम के साथ U7 snRNA आधार जोड़े और U7 snRNP catalyzes की उपइकाईयों में से एक, एक पाली (एक) पूंछ के बिना परिपक्व हिस्टोन mRNA पैदा करने वाली । 3 ‘ हिस्टोन पूर्व mRNA के अंत प्रसंस्करण भी स्टेम लूप बाध्यकारी प्रोटीन की आवश्यकता है (SLBP), जो एक संरक्षित स्टेम-पाश बांध दरार साइट के ऊपर स्थित है और सब्सट्रेट2,3करने के लिए U7 snRNP की भर्ती को बढ़ाता है । U7 snRNP के व्यक्तिगत घटकों की पहचान करने के उद्देश्य से अध्ययन पशु कोशिकाओं में U7 snRNP की कम एकाग्रता और अलग कर देना करने के लिए जटिल की प्रवृत्ति के कारण चुनौतीपूर्ण हो गया है या उपयोग करने का एक परिणाम के रूप में शुद्धि के दौरान आंशिक प्रोटियोलिसिस से गुजरना हल्के डिटर्जेंट4,5,6, उच्च नमक बहाकर और/या एकाधिक क्रोमेटोग्राफिक कदम7,8,9।
हाल ही में, U7-निर्भर प्रसंस्करण मशीनरी, हिस्टोन पूर्व की एक छोटी टुकड़ा या तो 3 ‘ या 5 ‘ पर बायोटिन युक्त mRNA की संरचना का निर्धारण करने के लिए एक परमाणु निकालने के साथ मशीन था और इकट्ठे परिसरों streptavidin पर कब्जा कर लिया गया लेपित agarose मोती५,६,१०. बायोटिन और streptavidin के बीच असाधारण मजबूत बातचीत के कारण, प्रोटीन streptavidin मोतियों पर मैटीरियल एसडीएस में उबलते द्वारा denaturing शर्तों के तहत eluted और चांदी धुंधला और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया । हालांकि इस सरल दृष्टिकोण U7 snRNP के घटकों के एक नंबर की पहचान की, यह अपेक्षाकृत कच्चे तेल के नमूनों की उपज, अक्सर पृष्ठभूमि प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के साथ दूषित विशेष रूप से streptavidin मोती के लिए बाध्य, संभवतः के कुछ घटकों मास्किंग प्रसंस्करण मशीनरी और चांदी सना हुआ जैल5,6,10पर उनके पता लगाने को रोकने के । महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण भी अलग सामग्री और इसके अतिरिक्त तरीकों से एकरूपता के लिए इसके आगे शुद्धि के साथ किसी भी कार्यात्मक अध्ययन precluded ।
संशोधनों के एक नंबर समय पर प्रस्तावित करने के लिए बायोटिन की वस्तुतः अपरिवर्तनीय प्रकृति का पता/streptavidin बातचीत कर रहे थे, उनमें से ज्यादातर के साथ या तो बातचीत को कमजोर करने के लिए या में एक रासायनिक वि हाथ प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया जा रहा बायोटिन युक्त रिएजेंट11,12. इन सभी संशोधनों के नकारात्मक पक्ष यह था कि वे काफी विधि की क्षमता को कम करने और/या अक्सर रेफरेंस कदम के दौरान गैर शारीरिक स्थितियों की आवश्यकता है, या तो अखंडता या शुद्ध प्रोटीन की गतिविधि को ख़तरे में डालना ।
यहां, हम एक अलग दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए बायोटिन की अंतर्निहित समस्या को हल करने के लिए streptavidin रणनीति आरएनए सब्सट्रेट जिसमें बायोटिन एक फोटो के माध्यम से 5 ‘ अंत करने के लिए संलग्न covalently है-सट 1-(2-nitrophenyl) एथिल moiety है कि लंबी लहर यूवी13,14के प्रति संवेदनशील । हम Drosophila और स्तनधारी परमाणु अर्क15से सीमित U7-निर्भर प्रसंस्करण मशीनरी की शुद्धि के लिए इस दृष्टिकोण का परीक्षण किया । हिस्टोन पूर्व की एक छोटी सी मशीन के बाद बायोटिन युक्त mRNA और फोटो-एक परमाणु उद्धरण के साथ सट linker, इकट्ठे प्रसंस्करण परिसरों streptavidin मोतियों पर स्थिर हैं, अच्छी तरह से धोया और धीरे से एक देशी में समाधान के लिए जारी ~ ३६० एनएम यूवी लाइट करने के लिए जोखिम से फार्म । यूवी-रेफरेंस विधि बहुत ही कुशल, तेज और सीधी, U7 snRNP की पर्याप्त मात्रा में उपज के रूप में कम से धुंधला अभिजात्य द्वारा अपने घटकों की कल्पना करने के लिए १०० µ एल निकालने के15। यूवी eluted सामग्री पृष्ठभूमि प्रोटीन और प्रत्यक्ष जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, अतिरिक्त शुद्धि कदम और एंजाइमी परख के लिए उपयुक्त से मुक्त है । एक ही विधि अंय आरएनए/प्रोटीन परिसरों कि अपेक्षाकृत कम आरएनए बाइंडिंग साइटों की आवश्यकता की शुद्धि के लिए अपनाया जा सकता है । बायोटिन और फोटो-सट linker भी एकल और दोहरे फंसे हुए डीएनए से जुड़ी covalently हो सकती है, संभावित रूप से विभिन्न डीएनए/प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की शुद्धि के लिए यूवी-रेफरेंस विधि का विस्तार ।
covalently संलग्न बायोटिन और फोटो-सट linker युक्त आरएनए के रासायनिक संश्लेषण केवल अनुक्रम है कि ~ ६५ न्यूक्लियोटाइड से अधिक नहीं है, महंगी और अक्षम बनने के लिए काफी लंबे समय अनुक्रम के साथ व्यावहारिक है । इस समस्या को हल करने के लिए, हम भी एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि बहुत लंबे समय तक आरएनए बाध्यकारी लक्ष्य के लिए उपयुक्त है विकसित की है । इस दृष्टिकोण में, किसी भी लंबाई और न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के आरएनए में T7 या SP6 प्रतिलेखन और annealed द्वारा इन विट्रो में उत्पन्न होता है एक छोटी पूरक oligonucleotide कि बायोटिन शामिल हैं और फोटो-‘ 5 अंत में सट लिंकर (ट्रांस विन्यास). परिणामी द्वैध बाद में व्यक्तिगत बाध्यकारी प्रोटीन या macromolecular परिसरों streptavidin मोतियों पर एक ही प्रोटोकॉल के लिए वर्णित के बाद शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें फोटो-सट बायोटिन संलग्न covalently (सीआईएस विन्यास). इस संशोधन के साथ, फोटो-सट बायोटिन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ इन विट्रो उत्पन्न न्यूक्लियोटाइड के सैकड़ों युक्त टेप, आरएनए की एक विस्तृत श्रृंखला की शुद्धि के लिए यूवी-रेफरेंस विधि का विस्तार/
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित विधि सीधी है और इसके अलावा एक फोटो-सट linker और यूवी-रेफरेंस स्टेप में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों से अलग नहीं होती है जो बायोटिन और streptavidin के बीच बेहद मजबूत बातचीत का लाभ उठाते हैं । यूव…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने काम के लिए उनके योगदान के लिए हमारे सहकर्मियों और सहयोगियों को धंयवाद । इस अध्ययन NIH अनुदान जीएम २९८३२ द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
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