Purificação de etapa única de complexos macromoleculares usando RNA ligado à biotina e um foto-cleavable vinculador
Summary
Complexos de RNA/proteínas purificados usando estratégia botin-streptavidin são eluídos a solução sob condições de desnaturação de forma inadequada para mais de purificação e análise funcional. Aqui, descrevemos uma modificação desta estratégia que utiliza um foto-cleavable vinculador em RNA e um passo de UV-eluição suave, produzindo complexos de RNA/proteína nativos e totalmente funcionais.
Abstract
Por muitos anos, a interação excepcionalmente forte e rapidamente formada entre biotina e streptavidin tem sido utilizada com sucesso para a purificação parcial de complexos de RNA/proteínas biologicamente importantes. No entanto, esta estratégia sofre uma grande desvantagem que limita a sua utilização mais ampla: a interação de biotina/estreptavidina pode ser quebrada apenas sob desnaturação condições que também interrompem a integridade dos complexos eluted, portanto, impedindo sua subsequente análise funcional e/ou purificação mais por outros métodos. Além disso, as amostras eluted são frequentemente contaminadas com as proteínas de fundo que associam nonspecifically com grânulos de estreptavidina, complicando a análise dos complexos purificadas pela coloração prata e espectrometria de massa. Para superar essas limitações, nós desenvolvemos uma variante da biotina/estreptavidina estratégia em que biotina é ligada a um substrato de RNA através de um foto-cleavable vinculador e os complexos imobilizados em grânulos streptavidin são seletivamente eluídos a solução em um forma nativa por ondas longas UV, deixando as proteínas de fundo sobre os grânulos. Substratos de ligação de RNA mais curtos podem ser sintetizados quimicamente com biotina e o foto-cleavable vinculador covalentemente ligado à extremidade 5′ do RNA, Considerando que mais substratos de RNA podem ser fornecidos com os dois grupos por do oligonucleotide complementar. Estas duas variantes do método UV-eluição foram testados para a purificação dos complexos processamento de U7 snRNP-dependente que cleave histona pre-mRNAs na extremidade 3′ e ambos provaram comparar favoravelmente com outros anteriormente desenvolvido métodos de purificação. As amostras de UV-eluída continham quantidades prontamente detectáveis da snRNP U7 que era livre de contaminantes de proteína maior e adequado para análise direta por espectrometria de massa e ensaios funcionais. O método descrito pode ser facilmente adaptado para a purificação de outros complexos de ligação de RNA e usado em conjunto com sites de single e double-stranded DNA ligando para purificar DNA específicas proteínas e complexos macromoleculares.
Introduction
Em eucariontes, precursores do RNA polimerase II-gerado mRNA (pre-mRNAs) submeter-se a vários eventos de maturação no núcleo antes de se tornar totalmente funcional modelos de mRNA para síntese de proteínas no citoplasma. Um desses eventos é o processamento de final 3′. Para a grande maioria dos pre-mRNAs, processamento de final 3′ envolve a clivagem acoplada a poliadenilação. Esta reação em duas fases é catalisada por um complexo relativamente abundante constituído por mais de 15 proteínas1. Animais de replicação dependente de histona pre-mRNAs são processados na extremidade 3′ por um mecanismo diferente em que o papel principal é interpretado por U7 snRNP, uma baixa abundância complexa consistindo de snRNA U7 de ~ 60 nucleotídeos e várias proteínas2,3 . Os pares de bases de snRNA U7 com uma sequência específica na histona pre-mRNA e uma das subunidades da snRNP U7 catalisa a reação de clivagem, gerando histona madura mRNA sem um poli da cauda. 3′ processamento de final de histona pre-mRNA também requer hairpin Loop ligação proteína (SLBP), que vincula um conservado Hairpin loop localizado a montante do local clivagem e melhora o recrutamento da snRNP U7 ao substrato2,3. Estudos que visam identificar os componentes individuais da snRNP U7 tem sido desafiadoras devido a baixa concentração do U7 snRNP em células animais e a tendência do complexo para dissociar ou sofrer proteólise parcial durante a purificação devido à utilização de detergentes suaves4,5,6, lavagens de sal elevadas e/ou múltiplas etapas cromatográficas7,8,9.
Recentemente, para determinar a composição das máquinas processamento U7-dependente, um pequeno fragmento de biotina contendo de histona pre-mRNA em 3′ ou 5′ foi incubado com um extrato nuclear e os complexos montados foram capturados na streptavidin-revestido agarose grânulos5,6,10. Devido a excepcionalmente forte interação entre biotina e estreptavidina, proteínas imobilizadas em grânulos streptavidin foram eluídas sob condições de desnaturação por ebulição em SDS e analisadas por coloração de prata e espectrometria de massa. Enquanto essa abordagem simples identificou uma série de componentes da snRNP U7, isso rendeu amostras relativamente brutas, muitas vezes contaminadas com um grande número de proteínas de fundo nonspecifically acoplado a grânulos de estreptavidina, potencialmente, mascarando alguns componentes do as máquinas de processamento e impedindo a sua detecção a prata manchada géis5,6,10. Importante, esta abordagem também impedida qualquer estudos funcionais com o material isolado e sua depuração adicional a homogeneidade por métodos adicionais.
Foram propostas várias modificações ao longo do tempo para abordar a natureza praticamente irreversível da biotina/estreptavidina interação, com a maioria deles sendo projetado ou enfraquecer a interação ou para fornecer um braço quimicamente cleavable espaçador na Biotina-contendo reagentes11,12. O lado negativo de todas essas modificações foi que eles reduzem significativamente a eficiência do método e/ou condições não-fisiológicas, muitas vezes exigidas durante a etapa de eluição, pondo em risco a integridade ou a atividade das proteínas purificadas.
Aqui, descrevemos uma abordagem diferente para resolver o problema inerente da biotina/estreptavidina estratégia usando o RNA de substratos em que biotina está covalentemente ligada à 5′ acabam através de uma foto-cleavable 1-(2-nitrofenil) moiety etílico que é sensível a onda longa UV13,14. Nós testamos esta abordagem para a purificação do mecanismo de processamento do limitante U7-dependente da drosófila e mamíferos nuclear extrai15. Após uma incubação curta de biotina contendo de histona pre-mRNA e o vinculador foto-cleavable com um extrato nuclear, os complexos de processamento montados são imobilizados em grânulos streptavidin, cuidadosamente lavados e lançados suavemente a solução em um nativo formulário pela exposição à luz de ~ 360 nm UV. O método de eluição de UV é muito eficiente, rápido e simples, produzindo quantidades suficientes da snRNP U7 Visualizar seus componentes por tira mancha de tão pouco como 100 µ l de extracto de15. O material UV-eluída é livre de proteínas de fundo e adequados para análise de espectrometria de massa direta, as etapas de purificação adicional e ensaios enzimáticos. O mesmo método pode ser adoptado para a purificação de outros complexos de RNA/proteína que exigem relativamente curtos locais obrigatórios de RNA. Biotina e o foto-cleavable vinculador também podem ser ligado covalentemente ligados para single – e ADN double-stranded, potencialmente estendendo-se o método de eluição de UV para a purificação de vários complexos de DNA/proteínas.
Síntese química de substratos de RNA contendo covalentemente ligados a biotina e o vinculador foto-cleavable é prático apenas com as sequências que não excedam ~ 65 nucleotídeos, tornando-se caro e ineficiente para sequências significativamente mais tempo. Para resolver este problema, desenvolvemos também uma abordagem alternativa que é adequada para alvos de ligação de RNA muito mais tempo. Nesta abordagem, RNA de qualquer sequência de comprimento e o nucleotídeo é gerado em vitro pela transcrição T7 ou SP6 e recozido para um curtas do oligonucleotide complementar que contém biotina e o foto-cleavable vinculador na extremidade 5′ (trans configuração). O duplex resultante é posteriormente usado para purificar proteínas individuais ou complexos macromoleculares em grânulos streptavidin seguindo o mesmo protocolo descrito para os substratos de RNA contendo biotina foto-cleavable ligada covalentemente (cis configuração). Com essa modificação, a foto-cleavable biotina pode ser usada em conjunto com transcrições em vitro gerado contendo centenas de nucleotídeos, estendendo-se o método de eluição de UV para a purificação de uma ampla gama de RNA/proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui é simples e, além disso incorporando um foto-cleavable vinculador e o passo de UV-eluição não difere os métodos comumente usados que tiram proveito da extremamente forte interação entre biotina e estreptavidina. A etapa de eluição de UV é muito eficiente, normalmente, liberando mais de 75% do RNA imobilizado e associados a proteínas de estreptavidina missanga, deixando para trás um fundo elevado de proteínas que se ligam não específica para as contas. Eliminando este pano de fundo,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a nossos colegas e colaboradores para a sua contribuição ao nosso trabalho. Este estudo foi suportado pelo NIH conceder GM 29832.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
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