Quantification des leucocytes évacuation via les vaisseaux lymphatiques de peau Murine et tumeurs
Summary
Ici, nous montrons les méthodes in vivo la quantification d’évacuation de leucocytes de naïve, enflammée et peau murine maligne. Nous effectuons une comparaison entre deux modèles : transdermique FITC application et in situ photoconversion. En outre, nous démontrent l’utilité de photoconversion pour le suivi des sorties de leucocytes de tumeurs cutanées.
Abstract
Sortie de leucocytes des tissus périphériques aux ganglions lymphatiques de drainage n’est pas seulement essentiel pour la surveillance du système immunitaire et initiation mais contribue aussi à la résolution des réactions des tissus périphériques. Bien qu’une variété de méthodes sont utilisées pour quantifier l’évacuation de leucocytes de tissus non lymphoïdes, périphériques, les mécanismes cellulaires et moléculaires qui gouvernent contextuel évacuation restent mal compris. Nous décrivons ici l’utilisation de photoconversion de in situ pour l’analyse quantitative d’évacuation de leucocytes de peau murine et tumeurs. Photoconversion permet l’étiquetage direct des leucocytes résidant dans les tissus cutanés. Bien que l’exposition de la peau aux ultraviolets provoque local réponses inflammatoires caractérisent par des infiltrats de leucocytes et de la perméabilité vasculaire, dans une comparaison entre application transdermique des traceurs fluorescents, photoconversion spécifiquement marqué les populations de migrateurs cellules dendritiques et activé simultanément la quantification d’évacuation myéloïde et lymphoïde de micro-environnements cutanées et tumeurs. Les mécanismes d’évacuation des leucocytes restent un élément manquant dans notre compréhension de la complexité des leucocytes intratumorale, et donc l’application des outils décrits dans les présentes fournira un aperçu unique de la dynamique de la tumeur des micro-environnements immunitaires à steady state et en réponse à la thérapie.
Introduction
Réponses immunitaires tissus périphériques sont formés non seulement par le recrutement des leucocytes aux sites d’inflammation, mais aussi par des mécanismes qui régulent leur maintien ultérieur. Ainsi, l’immunité protectrice est dictée par cumulatives mécanismes cellulaires et moléculaires qui déterminent si un leucocyte saisit, séjours au sein, ou plutôt migre dans les tissus périphériques via les vaisseaux lymphatiques. Ce qui est important, la propension des leucocytes à la sortie des tissus par les vaisseaux lymphatiques (appelés egress) est liée à leurs fonctions spécialisées. Les cellules dendritiques (DC) acquièrent un comportement migrateur en réponse aux signaux de maturation conduisant au transport de l’antigène et présentation à drainer des ganglions lymphatiques (RAD), un processus qui est nécessaire à l’immunité adaptative1. Nettoyage des cellules myéloïdes, telles que les macrophages et les neutrophiles, servent à dégager des débris d’apoptose par phagocytose. Au cours de l’infection bactérienne, neutrophiles évacuer les tissus et finalement apoptose dans dLNs2 et dans un modèle de colite induite par le DSS, données soutiennent l’hypothèse que l’évacuation des macrophages est nécessaire à la résolution de l’inflammation locale3. Évacuation des neutrophiles et les macrophages se soit produite dans tous les contextes inflammatoires, cependant, est inconnue. Éléments de preuve pour l’évacuation des lymphocytes T du regime4,5,6,7, infectés8et enflammée4,9,10, 11,12 des tissus périphériques, non lymphoïdes indique que les cellules T recirculer activement, même si les signaux sur tissus qui animent cette sortie restent mal compris. Plusieurs études ont identifié les signaux nécessaires à la migration directionnelle vers capillaires lymphatiques de drainage et ultérieures évacuation y compris ligand chemokine (C-C motif) 21 (CCL21) et son récepteur CCR74,11, 13, ligand chemokine (C-X-C motif) 12 (CXCL12) et son récepteur CXCR42,14et sphingosine-1-phosphate (S1P)10,15,16. Toutefois, ces mécanismes ne sont pas actifs dans tous les contextes, et qu’ils déterminent l’évacuation de tous les types de cellules reste une question ouverte. Ce qui est important, plus les mécanismes qui régissent l’évacuation et sa pertinence fonctionnelle dans la maladie exige que quantitative in vivo des méthodes d’analyse.
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour quantifier l’évacuation dans plusieurs modèles animaux in vivo , y compris une canulation directe des vaisseaux lymphatiques, transfert adoptif ex vivo étiqueté leucocytes, application transdermique des traceurs fluorescents, injection de particules marquées et in vivo photoconversion17,,18. Canulation directe des vaisseaux lymphatiques afférents de la souris est difficile et limitée chez de petits animaux par les volumes de liquide pouvant être collectées. Ainsi, canulation a largement été effectuée chez les grands animaux (p. ex.., moutons) où de telles manipulations chirurgicales sont pratiques. Ces études fournissent des preuves directes de la présence de cellules lymphoïdes et myéloïdes dans la lymphe10,19,20. En outre, modèles ovins révèlent que l’inflammation aiguë et chronique ont augmenté de présence de lymphocytes dans les ganglions de presque 100 fois10,21.
Transfert adoptif des lymphocytes étiquetées et génétiquement manipulés a surtout révélé que CCR7 est nécessaire pour l’évacuation des CD4+ T les cellules de5,peau enflammée aiguë11, tandis que le prétraitement des lymphocytes avec la petite molécule agoniste des récepteurs S1P, FTY720, inhibe partiellement leur sortie10. Fait intéressant, l’évacuation des lymphocytes transférés de peau chroniquement enflammée est indépendant du CCR710, mais peut exiger partiellement CXCR49. Expériences de transfert adoptif, cependant, livrer des numéros non physiologiques de ex vivo lymphocytes activés et étiquetées dans les tissus par injection, ce qui altère l’environnement biomécanique des tissus et des pressions élevées de fluide interstitielles qui ouvre les capillaires lymphatiques initiaux et modifier leurs propriétés de transport22. Comme alternative, application transdermique d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) en présence ou en absence d’irritants par voie cutanée (e.g., phtalate de dibutyle, DBP) ou infection23,24 permet le suivi des cellules phagocytaires qui s’accumulent à traceurs et de migrent vers dLNs. De même, tumeurs fluorescent étiquetés fournissent un moyen pour assurer le suivi des cellules phagocytaires qui ont englouti la tumeur matière25. Ces méthodes ont donné un important aperçu les mécanismes qui régissent DC sortie13,14,17,26,27 , mais sont incapables de suivre non phagocytaires lymphocytes et, l’interprétation peuvent être compliquées par drainage lymphatique libre du FITC soluble donc étiquetage non migratrice, LN DCs résidents.
Par ailleurs, la microscopie intravitale est un outil puissant qui permet en vivo suivi des populations de leucocytes physiologiquement pertinentes en temps réel28,29. Utilisé en combinaison avec la souris journaliste et axée sur les anticorps in vivo par immunofluorescence labeling, intravitale microscopie a révélé le complexe spatial et la dynamique temporelle d’immunitaire cellulaire traite, y comprises les migrations interstitielle30 , transmigration à travers l’endothélium lymphatique, le passage dans le lumen lymphatique et la migration sur LN entrée28,31. L’adoption généralisée de techniques d’imagerie intravitale est limitée par la dépense, l’expertise nécessaire pour mettre en place et limité le débit pour quantifier plusieurs types de cellules. Encore, les méthodes quantitatives qui analysent la dynamique des populations de couplage tissus avec imagerie intravitale fournira insight mécanistique supplémentaire et important en ce qui concerne les mécanismes de la motilité et la migration vers et au sein de capillaires lymphatiques 18 , 31 , 32.
Par conséquent, en vivo photoconversion a émergé comme une méthode qui permet d’in situ étiquetage, indépendante de l’activité phagocytaire et la quantification d’évacuation leucocytaire physiologique (lorsqu’il est couplé avec la cytométrie en flux) dans le absence ou présence de défi. Les souris Kaede-Tg expriment constitutivement une protéine isolée de stony corail qui présente une fluorescence verte (Kaede vert) jusqu’à ce que l’exposé à la lumière violette, après quoi il convertit irréversiblement à fluorescence rouge (rouge de Kaede)33. Photoconverted cellules peuvent être suivis comme ils sortir de sites tissulaires périphériques et s’accumulent dans dLNs. Ceci et autres34,des modèles de souris similaires et35 ont révélé importante biologie, y compris la sortie constitutive des lymphocytes T régulateurs de peau36, évacuation des lymphocytes B CXCR4 dépendant de plaques de Peyer37 , la mobilisation des cellules de mémoire résidente T sur le peptide re-défier38et de sortir de leucocyte large du tumeur microenvironnements39. Dans les présentes, nous effectuons une comparaison entre photoconversion avec application FITC transdermique dans le contexte d’inflammation cutanée et d’infection afin de permettre une comparaison directe des données existantes avec la méthode et. En outre, nous montrent photoconversion dans les tumeurs implantés et décrire l’efficacité de conversion et évacuation sélective des micro-environnements tumeur. Par conséquent, nous croyons que davantage l’application de ces méthodes est nécessaires pour élucider la biologie critique d’évacuation de leucocytes de tumeurs, ce qui aura des implications importantes pour l’interprétation de complexité de leucocyte intratumorale, immunité anti-tumorale, et réponse au traitement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que l’évacuation de leucocytes de tissus non lymphoïdes périphériques est essentielle pour l’initiation et la résolution des réponses immunitaires, les mécanismes moléculaires qui régissent l’évacuation sont mal compris. Cette lacune dans les connaissances est en grande partie en raison de la disponibilité d’outils permettant la quantification in vivo. Nous décrivons ici l’utilisation de la souris et à quantifier l’évacuation de leucocyte endogène de la peau et des tumeurs et de f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Marcus Bosenberg qui YUMM 1.1 et lignes de mélanomes murins YUMM 1.7 et Dr. Deborah J. Fowell permettant B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr souris en accord avec RIKEN BRC grâce à la Bio-ressource nationale du MEXT, Japon.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
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