Vi har tidigare använt en guld nanopartiklar peptid hybrid intravenöst leverera en syntetisk peptid, C-delta proteinkinashämmare, vilket minskade ischemi-reperfusion-inducerad akut lungskada. Här visar vi det detaljerade protokollet av drogen formuleringen. Andra intracellulära peptider kan formuleras på samma sätt.
C-delta proteinkinashämmare (PKCδi) är en lovande läkemedel för att förhindra ischemi-reperfusion-inducerad organ skada. Det är oftast konjugerat till en cell-penetrerande peptid, TAT, för intracellulära leverans. TAT har emellertid visat ospecifika biologiska aktiviteter. Guldnanopartiklar (BNI) kan användas som drogen leverans bärare utan erkända toxicitet. Därför har vi använt en GNP/peptid hybrid för att leverera PKCδi. Två korta peptider (P2: CAAAAE och P4: CAAAAW), i förhållandet 95:5, användes för att modifiera ytegenskaper av BNP. BNI konjugerat med PKCδi (GNP/PKCi) är stabila i destillerat vatten, 0,9% NaCl och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande bovint serum albumin eller fetalt bovint serum. Intravenös injektion av GNP-PKCi var tidigare visat att förhindra ischemi-reperfusionsskada i lungan. Denna artikel beskriver ett protokoll för att formulera GNP/PKCi och bedöma fysiokemiska egenskaper GNP/PKCi. Vi har använt liknande metoder för att formulera andra peptidbaserade droger med BNP. Denna artikel kommer förhoppningsvis dra mer uppmärksamhet till denna roman intracellulära drogen leverans teknik och dess tillämpningar i vivo.
Lungtransplantation sparar patienter med slutstadiet lung sjukdom1. Allvarliga komplikationer efter lungtransplantation är dock ett hinder. I ett tidigt skede efter lungtransplantation, primära transplantatdysfunktion är den mest skadliga komplikation1och dess primära orsak är ischemi-reperfusion (IR)-inducerad akut lung skada2.
Under kalla konservering är metabolism i en donator lunga begränsad till en mycket låg nivå. Dock aktiveras reaktiva syreradikaler och kväveoxid syntesen på grund av upphörande av blod flöde3. Efter transplantation, blodcirkulationen är återställd, och reaktiva syreradikaler och kväveoxid som genereras under kall ischemi öka inflammation och celldöd död, vilket resulterar i vävnadsskada.
För att förhindra IR skada, har en Cδ proteinkinashämmare (PKCδi) använts i hjärta, hjärna och lungor4,5,6,7,8. Dessa studier visade att PKCδi minskade inflammation och apoptos under reperfusion. Det har också förhindrat pulmonell IR skada i råttor och en lung transplantation modell6. PKCδi är vanligtvis konjugerat med en cell-penetrerande peptid, TAT, för intracellulära leverans. Det har dock visat att TAT peptiden ensam har ospecifika biologiska effekter, inbegripet främjande av angiogenes, apoptos och hämning av flera cytokiner9,10,11. Nanopartiklar, små partiklar som sträcker sig från 1 till 100 nm i diameter12, har undersökts som kandidater för att underlätta drogen leverans13. I synnerhet betraktas guld nanopartiklar (BNI) som icke-invasiv och giftfritt. Därför har vi utvecklat BNI som drogen leverans bärare för peptid-baserad droger14,15.
Ytan av BNI kan manipuleras för specifika applikationer såsom molekylär igenkänning16,17, kemiska fjärranalys18, imaging19och drug delivery. En GNP/peptid hybrid-systemet har utvecklats, som innehåller 20 nm BNI och två korta peptider (P2: CAAAAE och P4: CAAAAW) i förhållandet 95:5, att ändra ytegenskaper av BNI. P2 peptiden, med negativt laddad glutaminsyra (E) i slutet, stabiliserar BNI i vattenlösning, och P4 peptiden, med den hydrofoba tryptofan (W) i slutet, hjälper BNI hänrycka in i celler14. Cysteinrest (C) vid den N ändstationen av dessa peptider innehåller en tiolgrupp som kan böja till guld ytor14. Denna peptid/GNP hybrid användes ytterligare att leverera PKCδi (CSFNSYELGSL). Optimerad molar förhållandet av P2:P4 till PKCδi är 47.5:2.5:50. BNI konjugerat med PKCδi (GNP/PKCi) är stabil i destillerat vatten, 0,9% NaCl och PBS som innehåller bovint albumin eller fetalt bovint serum14. Intravenös injektion av GNP/PKCi har visat sig förhindra ischemi-reperfusionsskada av lungcancer15. Denna artikel beskriver en metod för att formulera GNP/PKCi och beskriver hur du utvärdera GNP/PKCi fysikalisk-kemiska egenskaper. Vi har använt liknande metoder för att formulera andra peptidbaserade droger konjugerat till GNP20,21,22. Vi hoppas att denna artikel kommer att dra mer uppmärksamhet åt denna nya formulering för intracellulära drogen leverans.
För att säkerställa korrekt formulering, är det viktigt att δPKCi lösningen genomgår den ultraljudsbehandling steg beskrivs i 1.6. ΔPKCi peptid sekvens innehåller hydrofoba delarna, så en någon sonikator bistår i upplösning PKCi i 50% acetonitril lösningen. Dessutom är det mycket viktigt att blanda spädningsvätskan minutiöst, som beskrivs i steg 2,7. GNP/PKCi hybrid kommer inte vara väl formulerade om dessa steg inte göras ordentligt, på grund av aggregering av den δPKCi peptid23…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av forskningsanslag från kanadensiska institut för hälsa forskning (PJT-148847), ministeriet för forskning och Innovation av Ontario (RE-08-029) och Kanada första forskning av Excellence Program, medicin genom Design vid University of Toronto. Dr. Mingyao Liu är James och Mary Davie stol i lungskada, reparation och förnyelse.
negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |