البروتين كيناز ج-دلتا "الببتيد المانع صياغة" استخدام "الذهب جسيمات نانوية"
Summary
وقد استخدمنا سابقا هجين ببتيد نانوحبيبات الذهب لتسليم عن طريق الوريد الببتيد الاصطناعية، مثبط البروتين كيناز ج-دلتا، مما خفض إصابة الرئة الحاد الناجم عن ضخه الاسكيمية. هنا نعرض البروتوكول مفصلاً لوضع المخدرات. يمكن أن تصاغ الببتيدات داخل الخلايا الأخرى وعلى نحو مماثل.
Abstract
مثبطات البروتين كيناز ج-دلتا (PKCδi) دواء واعداً لمنع الضرر الناجم عن ضخه الاسكيمية الجهاز. هو عادة مترافق لاختراق الخلية ببتيد، تأت، للتسليم داخل الخلايا. ومع ذلك، أظهرت تأت الأنشطة البيولوجية غير محددة. يمكن استخدام الجسيمات النانوية الذهبية (قومي) كشركات تسليم المخدرات دون سمية المعترف بها. ولذلك، فقد استخدمنا هجين الناتج القومي الإجمالي/ببتيد لتسليم PKCδi. اثنين قصيرة الببتيدات (P2: كااا و P4: كووو)، بنسبة نمط، واستخدمت لتعديل خصائص السطح من الناتج القومي الإجمالي. قومي مترافق مع PKCδi (الناتج القومي الإجمالي/بكسي) مستقرة في الماء المقطر، 0.9% كلوريد الصوديوم، وفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تحتوي على ألبومين المصل البقري أو المصل البقري الجنين. وأبدى سابقا الحقن الوريدي من الناتج القومي الإجمالي-بكسي لمنع الإصابة الاسكيمية-ضخه في الرئة. توضح هذه المقالة بروتوكول لصياغة الناتج القومي الإجمالي/بكسي وتقييم الخصائص الفيزيائية للناتج القومي الإجمالي/بكسي. لقد استخدمنا أساليب مماثلة لوضع المخدرات الأخرى المستندة إلى ببتيد مع الناتج القومي الإجمالي. سوف يوجه هذا المقال نأمل المزيد من الاهتمام لهذه التكنولوجيا تقديم رواية المخدرات داخل الخلايا وتطبيقاتها المجراة.
Introduction
زرع الرئة يحفظ المرضى ب أمراض الرئة نهاية مرحلة1. ومع ذلك، تبقى مضاعفات خطيرة بعد زرع الرئة عقبة. في المراحل الأولى بعد زرع الرئة، هو الخلل الأساسي الابتزاز المضاعفات الضارة الأكثر1، وأن السبب الرئيسي هو الاسكيمية-الاكسجينيه (الأشعة تحت الحمراء)-الناجم عن إصابة الرئة الحاد2.
قيد الحفظ بالتبريد، يقتصر التمثيل الغذائي في الرئة المانحين إلى مستوى منخفض جداً. ومع ذلك، يتم تنشيط الأنواع الأكسجين التفاعلية وتوليف أكسيد النيتريك نظراً لوقف تدفق الدم3. بعد زرع الأعضاء، يتم استعادة الدورة الدموية، والأنواع الأكسجين التفاعلية وأكسيد النيتريك التي تم إنشاؤها أثناء الاسكيمية الباردة تعزيز التهاب وخلية الموت، أسفر عن إصابة الأنسجة.
وقد استخدمت لمنع ضرر الأشعة تحت الحمراء، مثبط Cδ كيناز بروتين (PKCδi) في القلب والمخ والرئة4،5،،من67،8. وأظهرت هذه الدراسات أن تناقص PKCδi التهاب والمبرمج أثناء ضخه. كما منعت الإصابة الأشعة تحت الحمراء الرئوية في الفئران و نموذج عملية زرع الرئة6. هو عادة مترافق PKCδi مع اختراق الخلية ببتيد، تأت، للتسليم داخل الخلايا. بيد أنه قد ثبت أن الببتيد تأت وحدها قد آثار بيولوجية غير محددة، بما في ذلك الترويج للأوعية، والمبرمج، وتثبيط السيتوكينات متعددة9،،من1011. جسيمات نانوية، جزيئات صغيرة تتراوح بين 1 إلى 100 نانومتر في قطرها12، تم استكشاف كمرشحين في تسهيل إيصال المخدرات13. على وجه الخصوص، تعتبر جسيمات نانوية الذهب (قومي) موسع وغير سام. ولذلك، قمنا بتطوير قومي كالمخدرات تسليم ناقلات للمخدرات على أساس الببتيد،من1415.
يمكن التلاعب بها سطح قومي لتطبيقات محددة مثل التعرف الجزيئي16،17و الاستشعار الكيميائية18و التصوير19وإيصال الأدوية. تم تطوير نظام هجين الناتج القومي الإجمالي/ببتيد، الذي يحتوي على 20 نانومتر قومي واثنين من الببتيدات قصيرة (P2: كااا و P4: كووو) بنسبة نمط، لتعديل خصائص السطح من قومي. الببتيد P2، مع حمض الجلوتاميك مشحونة سلبا (ه) في النهاية، تستقر قومي في محلول مائي، ويساعد الببتيد P4، مع التربتوفان مسعور (W) في النهاية، قومي مدخل داخل الخلايا14. بقايا السيستين (ج) في المحطة ن من هذه الببتيدات تحتوي على مجموعة ثيول يمكن مترافق ل الأسطح الذهب14. كذلك استخدمت هذا الهجين الناتج القومي الإجمالي الببتيد لتسليم PKCδi (كسفنسييلجسل). نسبة المولى محسن P2:P4 أن PKCδi هو 47.5:2.5:50. قومي مترافق مع PKCδi (الناتج القومي الإجمالي/بكسي) هي مستقرة في الماء المقطر، 0.9% كلوريد الصوديوم، وبرنامج تلفزيوني يحتوي على الزلال البقري أو المصل البقري الجنين14. لقد ثبت الحقن الوريدي من الناتج القومي الإجمالي/بكسي لمنع الإصابة ضخه الاسكيمية الرئة15. هذه الوثيقة بالتفصيل أسلوب صياغة الناتج القومي الإجمالي/بكسي ويصف كيفية تقييم الخصائص الفيزيائية للناتج القومي الإجمالي/بكسي. لقد استخدمنا أساليب مماثلة لوضع المخدرات الأخرى الببتيد يضاف إلى الناتج القومي الإجمالي20،،من2122. نأمل أن هذه المادة سيتم توجيه مزيد من الاهتمام لصياغة هذه الرواية لإيصال المخدرات داخل الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
لضمان صياغة سليمة، من الأهمية بمكان أن يخضع الحل δPKCi خطوة سونيكيشن المبينة في 1.6. ΔPKCi الببتيد تسلسل يحتوي على مويتيس مسعور، حيث سونيكاتور ويساعد في إذابة بكسي في الحل الاسيتو الانيتريل 50%. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم جداً لخلط المذيبات دقة، كما هو موضح في الخطوة 2.7. الهجين الناتج القومي ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل المنح البحثية من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-148847) ووزارة البحث والابتكار في أونتاريو (RE-08-029) وكندا البحث الأولى للتميز البرنامج، الطب حسب التصميم في جامعة تورنتو. الدكتور ليو مينجياو هو جيمس وماري دافي الرئاسة في إصابة الرئة، وإصلاح وتجديد.
Materials
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report–2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neurosciences. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
