С помощью пузырчатая maydis как троянский конь в месте доставки кукурузу белков
Summary
Эта работа описывает клонирования штамма троянский конь пузырчатая maydis на месте доставки секретируемые белки кукурузы в три различных видов кукурузы тканей.
Abstract
Вдохновленный Homer´s троянский конь миф, мы инженерии кукурузы возбудителя пузырчатая maydis доставить секретируемые белки в кукурузы апопласт, позволяющие в естественных условиях фенотипического анализа. Этот метод не полагаться на кукурузу трансформации, но подвиги микробной генетики и секреторную возможности патогенов. Здесь он позволяет осмотр в естественных условиях доставлены секретируемые белки с высоким пространственно-временных резолюции на различные виды сайтов инфекции и тканей. Троянский конь стратегия может быть использован для временно дополнять кукурузы фенотипы функция потерь, функционально характеризовать доменов протеина, анализировать-целевого белка эффекты, или для изучения передозировка играющий белка, что делает его мощным инструментом для изучений протеина в системе урожая кукурузы. Эта работа содержит точный протокол о том, как генерировать штамм троянский конь, следуют стандартизированных инфекции протоколы применить этот метод к трем типам различных кукурузы ткани.
Introduction
Возбудитель biotrophic maydis пузырчатая является возбудителем болезни головня кукурузы1. Он заражает все надземные части кукурузы, что приводит к большой опухоли, которые содержат споры melanized, черный. На глобальном уровне U. maydis оценивается вызвать ежегодные потери около 2% урожая кукурузы, в то время как опухоли ценятся как гастрономическим деликатесом в Мексике. Аппрессории, который выделяет лизировать ферменты клеточной стенки проникнуть первый слой кукурузы эпидермальных клеток инициируется завод инфекции. С сайта первичной инфекции U. maydis растет внутриклеточно и intercellularly, вторгаясь клетки один или два слоя каждый день1,2. Успешное инфекции приводит к гипертрофии завод, который превращается в видимые опухоли после пяти дней должность инфекции1,3,4. На всех стадиях инфекции грибные гифы инвагинировать мембраны цитоплазме завод без прямого контакта в цитоплазме принимающей1,2. Жесткие apoplasmic пространство между заражение гифы и завод плазматической мембраны считается хост/возбудителя интерактивный сайт, называется biotrophic зоны взаимодействия. Для того, чтобы преодолеть иммунной системы растений, U. maydis выделяет массив эффекторных белков в biotrophic взаимодействия зоны1. Некоторые эффекторов занимают растительных клеток, в то время как другие остаются в biotrophic взаимодействия зоны5,6,,78. Один apoplastic эффектора — UmPit2, который взаимодействует с apoplastic кукурузы протеазы для предотвращения выхода сигнальный пептид ZmZIP1 от ZmPROZIP,apoplastic протеазы деятельность910.
За последние десятилетия U. maydis стал не только модель для грибковых генетики растений возбудитель взаимодействия, но и ценным инструментом в области биотехнологии в силу понятных жизненного цикла, доступность генетических и гетерологичных выражение выделяется белки11,12,13. Сигналы для обоих традиционных и нетрадиционных белка секрецию были определены разрешение контроль Посттрансляционная изменения14. Недавно U. maydis работал как троянский конь инструмент для изучения малых, выделяется кукуруза белков в situ15. Троянский конь подход успешно использовался для анализа функции небольшой, выделяется белка ZmMAC1, который участвует в развитии пыльников. ZmMAC1 вызывает periclinal разделение плюрипотентных клеток и клеток судьба спецификации новообразованной клетки15. Таким же методом была выявлена биологическая функция кукурузы ущерб связанных пептидной ZmZIP1. U. maydis секреции кукурузы, ZmZIP1 привели к нарушение формирования опухоли10. Таким образом троянский конь подход представляет ценные альтернативный маршрут для белка в situ исследований с высоким пространственно-временных резолюцией, которая делает не требуют поколение стабильной кукурузы преобразование линии ни инфильтрации тканей с участием выраженное и очищенных белков. В частности троянский конь стратегия позволяет секрецию любой гетерологичных белка в кукурузы Апопласт и прямое сравнение инфицированных и неинфицированных растительных клеток внутри же ткани.
Этот протокол иллюстрирует основные шаги для создания штамма троянский конь U. maydis для изучения протеина интереса. Она далее включает в себя точную информацию о процедурах инфекции трех типов различных кукурузы ткани (взрослый листья, кистями и уши) с U. maydis, который является предпосылкой для изучения пространственно-временных инфекции прогрессии и белков функции в этих тканях-мишенях. Без дальнейших спецификаций приводятся кукурузы амплификации генов и микроскопических изображений техники, поскольку эти шаги являются целевыми и инструмент зависимой. Таким образом этот протокол предназначен для опытных пользователей стандартных молекулярные методы биологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследование современных культур требует протоколы для молекулярного анализа генетических и уровни белка. Генетическая доступность через преобразование не доступен или неэффективным и трудоемким для большинства видов сельскохозяйственных культур, например кукурузы. Кроме тог…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Томас Дресселгауз, Мартин Parniske, Нуреддин Djella и Армин Хильдебранд для предоставления лаборатории пространства и растительных материалов. Оригинальные работы по методу троянский конь было поддержано Леопольдина постдока стипендий и NSF проекта IOS13-39229. Работы, представленные в этой статье было поддержано SFB924 (проекты A14 и В14) от DFG.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Biologie du développement. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
