استخدام مايديس Ustilago كحصان طروادة "إيصال بروتينات الذرة في الموقع"
Summary
ويصف هذا العمل استنساخ عبئا مايديس Ustilago حصان طروادة لإيصال بروتينات الذرة يفرز في الموقع إلى ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة.
Abstract
مستوحاة من أسطورة حصان طروادة Homer´s، نحن هندسيا الممرض مايديس Ustilago توصيل البروتينات يفرزها إلى أبوبلاست الذرة التي تسمح بتحليل المظهرية المجراة في الذرة. هذا الأسلوب لا يعتمد على تحويل الذرة ولكن يستغل قدرات الافرازية من مسببات الأمراض وعلم الوراثة الميكروبية. هذه الوثيقة، فإنه يسمح تفتيش المجراة في تسليم البروتينات يفرزها مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية في أنواع مختلفة من مواقع الإصابة والأنسجة. يمكن استخدامها لعابر يكمل الذرة خسارة للدالة تعمل، لتوصيف وظيفيا نطاقات البروتين، لتحليل آثار البروتين خارج الهدف، أو لدراسة البروتين هدوئي الجرعة الزائدة، مما يجعله أداة قوية لاستراتيجية حصان طروادة دراسات البروتين في النظام محصول الذرة. ويتضمن هذا العمل بروتوكول دقيق بشأن كيفية توليد سلالة حصان طروادة تليها البروتوكولات العدوى موحدة لتطبيق هذا الأسلوب على ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة.
Introduction
الممرض بيوتروفيك مايديس Ustilago هو المسبّب ل مرض التفحم الذرة1. أنه يصيب جميع أجزاء الجوي من الذرة الناتج في الأورام الكبيرة التي تحتوي على جراثيم ميلانيزيد، أسود. على الصعيد العالمي، يقدر مايديس U. يسبب خسارة سنوية من حوالي 2 في المائة محصول الذرة، بينما تقدر الأورام كطعام شهي تذوقي في المكسيك. مصنع العدوى هو بدأها أبريسوريوم التي تفرز الإنزيمات ليسينج جدار الخلية لاختراق الطبقة الأولى من خلايا البشرة الذرة. من موقع إصابة الأولية، ينمو مايديس U. إينتراسيلولارلي وإينتيرسيلولارلي، وغزو الخلية واحد إلى اثنين طبقات كل يوم1،2. نتائج الإصابة بنجاح في تضخم النباتات التي تتحول إلى أورام مرئية إلى خمسة أيام بعد الإصابة1،،من34. خلال جميع مراحل العدوى، إينفاجيناتي الفطرية خيوط فطرية الغشاء الهيولى المصنع دون أي اتصال مباشر إلى1،السيتوبلازم المضيف2. أبوبلاسميك ضيق المساحة بين خيوط فطرية إصابة وغشاء البلازما النبات يعتبر الموقع المضيف/الممرض التفاعلية، وتسمى منطقة التفاعل بيوتروفيك. وللتغلب على نظام المناعة الفطرية النباتية، تفرز U. مايديس صفيف بروتينات المستجيب في منطقة التفاعل بيوتروفيك1. وتتخذ بعض المستجيبة بالخلايا النباتية، بينما البعض الآخر لا يزال في بيوتروفيك تفاعل المنطقة5،6،،من78. واحد أبوبلاستيك المستجيب هو UmPit2، الذي يتفاعل مع البروتياز أبوبلاستيك الذرة لمنع الإفراج عن الببتيد ZmZIP1 من زمبروزيب،أبوبلاستيك البروتياز النشاط9مما يشير إلى10.
على مدى العقود الماضية، U. مايديس أصبح ليس إلا نموذجا لعلم الوراثة الفطرية في تفاعل الكائنات الممرضة النباتية، ولكن أيضا أداة قيمة في مجال التكنولوجيا الأحيائية بسبب دورة الحياة مفهومة جيدا، سهولة الوراثية وتعبير مغايرة يفرز البروتينات11،،من1213. إشارات لإفراز البروتين التقليدية وغير التقليدية على حد سواء قد تم تحديد السماح بالتحكم في تعديلات بوستترانسلاشونال14. في الآونة الأخيرة، استخدمت U. مايديس كأداة حصان طروادة لدراسة صغيرة، ويفرز البروتينات الذرة في الموقع15. النهج حصان طروادة الذي استخدمت بنجاح لتحليل وظيفة البروتين الصغيرة، ويفرز ZmMAC1 التي تشارك في وضع العضو الذكرى. ZmMAC1 يدفع شعبة بيريكلينال pluripotent الخلايا ومواصفات مصير خلية من خلايا المنشأ حديثا15. بنفس الطريقة، كشف عن الوظيفة البيولوجية للذرة الببتيد المرتبط بالضرر ZmZIP1. مايديس U. إفراز الذرة ZmZIP1 أدت إلى إعاقة الورم تشكيل10. وهكذا، تمثل النهج حصان طروادة طريقا بديلة قيماً للبروتين في دراسات الموقع مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية التي لا لا تتطلب توليد خطوط تحويل الذرة مستقرة ولا تسلل الأنسجة مع هيتيرولوجوسلي أعرب عنه وتنقية البروتينات. على وجه الخصوص، استراتيجية حصان طروادة يتيح إفراز أي البروتين مغايرة في أبوبلاست الذرة والمقارنة المباشرة للمصابين مقابل الخلايا النباتية غير المصابة داخل النسيج نفسه.
هذا البروتوكول يوضح الخطوات الرئيسية لتوليد عبئا حصان طروادة مايديس الولايات المتحدة لدراسة وتين فائدة. كذلك يتضمن معلومات دقيقة عن إجراءات العدوى من ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة (أوراق الكبار، شرابات وآذان) مع مايديس شين، الذي شرط أساسي لدراسة وظيفة البروتين وتطور الإصابة الزمانية المكانية في هذه الأنسجة المستهدفة. أي مواصفات أخرى معين على الذرة الجينات التضخيم والمجهري تقنيات، التصوير منذ هذه الخطوات محددة الهدف وتعتمد على الصك. وهكذا، هذا البروتوكول هو موجهة إلى المستخدمين ذوي الخبرة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بحوث المحاصيل الحديثة تتطلب البروتوكولات للتحليل الجزيئي في الجينية ومستويات البروتين. الوصول الوراثية عن طريق التحول غير متاح أو غير فعال وتستغرق وقتاً طويلاً لمعظم أنواع المحاصيل مثل الذرة. وعلاوة على ذلك، الأدوات الوراثية الموثوقة، مثل نظم مراسل المروج نادرة، مما يجعل من الصعب ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر هيلدبراند أرمين ونور الدين ديلا، توماس دريسيلهاوس ومارتن بارنيسكي لتوفير مواد المختبر الفضائي ومحطة. كان يدعمها العمل الأصلي على طريقة حصان طروادة زمالة بوستدوك ليوبولدينا وجبهة الخلاص الوطني المشروع IOS13-39229. وأيد SFB924 (مشاريع A14 و B14) من DFG العمل المعروضة في هذه المقالة.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Biologie du développement. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
