मकई प्रोटीन की सीटू प्रसव में के लिए एक ट्रोजन हॉर्स के रूप में Ustilago मेडिस का उपयोग
Summary
इस काम का वर्णन एक Ustilago मेडिस ट्रोजन हॉर्स तनाव के लिए में सीटू प्रसव के लिए स्रावित मक्का प्रोटीन की क्लोनिंग मक्का के ऊतकों के तीन विभिन्न प्रकार में.
Abstract
होमर ´ एस ट्रोजन हॉर्स मिथक से प्रेरित होकर, हम मक्का रोगज़नक़ Ustilago मेडिस vivo phenotypic विश्लेषण में अनुमति apoplast मक्का में स्रावित प्रोटीन देने के लिए इंजीनियर । इस विधि मक्का परिवर्तन पर निर्भर नहीं करता है, लेकिन माइक्रोबियल आनुवंशिकी और रोगजनकों के स्रावी क्षमताओं का दोहन । इस के साथ साथ, यह के निरीक्षण की अनुमति देता है vivo में संक्रमण साइटों और ऊतकों के विभिंन प्रकार पर उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ स्रावित प्रोटीन दिया । ट्रोजन हॉर्स रणनीति क्षणिक मक्का नुकसान का उपयोग किया जा सकता है-समारोह phenotypes, कार्यात्मक प्रोटीन डोमेन विशेषताएं करने के लिए, ऑफ लक्ष्य प्रोटीन प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, या onside प्रोटीन खुराक का अध्ययन करने के लिए, यह एक शक्तिशाली उपकरण बनाने के लिए खाद्यान फसल प्रणाली में प्रोटीन की पढ़ाई । यह काम कैसे एक ट्रोजन हॉर्स मानकीकृत संक्रमण प्रोटोकॉल के बाद तनाव उत्पंन करने के लिए तीन अलग मक्का ऊतक प्रकार के लिए इस पद्धति को लागू करने पर एक सटीक प्रोटोकॉल शामिल हैं ।
Introduction
biotrophic रोगज़नक़ Ustilago मेडिस मकई मैल रोग की प्रेरणा का एजेंट है1। यह बड़े ट्यूमर में जिसके परिणामस्वरूप मक्का के सभी हवाई भागों को संक्रमित करता है जिसमें melanized, काले बीजाणु होते हैं । वैश्विक स्तर पर, मेडिस को मकई की उपज के लगभग 2% की वार्षिक हानि का कारण अनुमान है, जबकि ट्यूमर मेक्सिको में एक लजीज विनंरता के रूप में सराहना की जाती है । संयंत्र संक्रमण एक appressorium है कि सेल दीवार lysing एंजाइमों को मक्का एपिडर्मल कोशिकाओं की पहली परत घुसना स्रावित द्वारा शुरू की है । एक प्राथमिक संक्रमण साइट से, मेडिस intracellularly और सेलुलर बढ़ता है, एक दो सेल परतों हर दिन1,2पर हमला । संयंत्र अतिवृद्धि में सफल संक्रमण के परिणाम है कि पांच दिनों के बाद संक्रमण1,3,4पर दिखाई ट्यूमर में बदल जाता है । सभी संक्रमण चरणों के दौरान, कवक hyphae invaginate के बिना किसी भी सीधे संपर्क के संयंत्र कोशिका द्रव्य झिल्ली कोशिका द्रव्य1,2। संक्रमित hyphae और संयंत्र प्लाज्मा झिल्ली के बीच तंग apoplasmic अंतरिक्ष मेजबान/रोगज़नक़ इंटरएक्टिव साइट माना जाता है, biotrophic संपर्क क्षेत्र कहा जाता है । आदेश में संयंत्र जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली को दूर करने के लिए, मेडिस biotrophic संपर्क क्षेत्र1में प्रभावक प्रोटीन की एक सरणी स्रावित । कुछ प्रभाव संयंत्र कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, जबकि अंय biotrophic संपर्क क्षेत्र5,6,7,8में रहते हैं । एक apoplastic प्रभाव UmPit2 है, जो apoplastic मक्का के साथ सूचना का आदान प्रदान करने के लिए ZmPROZIP से संकेतन पेप्टाइड ZmZIP1 की रिहाई को रोकने के साथ इंटरैक्ट करता गतिविधि9,10।
पिछले दशकों में, मेडिस न केवल संयंत्र में कवक आनुवंशिकी के लिए एक मॉडल-रोगज़नक़ संपर्क बन गया है , लेकिन यह भी एक अच्छी तरह से समझ में आ जीवन चक्र, आसान आनुवंशिक पहुंच और heterologous अभिव्यक्ति की वजह से जैव प्रौद्योगिकी में एक महत्वपूर्ण उपकरण स्रावित प्रोटीन्स11,12,13. दोनों पारंपरिक और अपरंपरागत प्रोटीन स्राव के लिए संकेत posttranslational संशोधनों के नियंत्रण की अनुमति निर्धारित किया गया है14। हाल ही में, मेडिस 15सीटू में छोटे, गुप्त मक्का प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक ट्रोजन हॉर्स उपकरण के रूप में कार्यरत था । ट्रोजन हॉर्स दृष्टिकोण सफलतापूर्वक छोटे, गुप्त प्रोटीन ZmMAC1 है कि anther विकास में शामिल है के समारोह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ZmMAC1 नई गठित कोशिकाओं के pluripotent कोशिकाओं और सेल भाग्य विनिर्देश के periclinal विभाजन लाती है15. इसी विधि द्वारा खाद्यान क्षति से संबंधित पेप्टाइड ZmZIP1 के जैविक कार्य का पता चला । यू मेडिस स्रावित मक्का ZmZIP1 बिगड़ा ट्यूमर गठन10में हुई । इस प्रकार, ट्रोजन हॉर्स दृष्टिकोण उच्च spatiotemporal संकल्प है कि न तो स्थिर मक्का परिवर्तन लाइनों के उत्पादन की आवश्यकता होती है और न ही heterologously के साथ ऊतक घुसपैठ के साथ सीटू के अध्ययन में प्रोटीन के लिए एक मूल्यवान वैकल्पिक मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है व्यक्त और शुद्ध प्रोटीन । विशेष रूप से, ट्रोजन हॉर्स रणनीति एक ही ऊतक के भीतर मक्का apoplast और संक्रमित बनाम गैर संक्रमित संयंत्र कोशिकाओं के प्रत्यक्ष तुलना में किसी भी heterologous प्रोटीन के स्राव को सक्षम बनाता है ।
इस प्रोटोकॉल एक यू मेडिस ट्रोजन हार्स तनाव पैदा करने के लिए ब्याज की एक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए प्रमुख कदम दिखाता है । यह आगे spatiotemporal संक्रमण प्रगति और प्रोटीन समारोह का अध्ययन करने के लिए एक शर्त है जो मेडिसके साथ तीन अलग मक्का ऊतक प्रकार (वयस्क पत्तियों, लटकन और कान) के संक्रमण प्रक्रियाओं पर सटीक जानकारी शामिल इन लक्ष्य ऊतकों में । कोई आगे विनिर्देशों मक्का जीन प्रवर्धन और सूक्ष्म इमेजिंग तकनीक पर दिया जाता है, क्योंकि इन कदमों के लक्ष्य विशिष्ट और साधन-निर्भर कर रहे हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल मानक आणविक जीवविज्ञान तकनीक के अनुभवी उपयोगकर्ताओं को संबोधित किया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आधुनिक फसल अनुसंधान आनुवंशिक और प्रोटीन के स्तर पर आणविक विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल की मांग । परिवर्तन के माध्यम से आनुवंशिक पहुंच उपलब्ध है या अक्षम और मक्का के रूप में सबसे अधिक फसल प्रजातियों के …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक थॉमस Dresselhaus, मार्टिन Parniske, Noureddine Djella, और आर्मिन Hildebrand लैब अंतरिक्ष और संयंत्र सामग्री प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । ट्रोजन हॉर्स विधि पर मूल काम एक Leopoldina postdoc फैलोशिप और NSF परियोजना IOS13-39229 द्वारा समर्थित किया गया था । इस लेख में प्रस्तुत कार्य को DFG के SFB924 (प्रोजेक्ट्स A14 एण्ड B14) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
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