원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하
Summary
이 작품 옥수수 조직의 세 가지 유형으로 옥수수 단백질 분 비의 원래의 장소에 배달에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 스트레인의 복제에 대해 설명 합니다.
Abstract
Homer´s 트로이 말 신화에서 영감을, 우리 옥수수 병원 체 Ustilago maydis vivo에서 phenotypic 분석을 허용 하는 옥수수 apoplast으로 분 비 단백질을 제공 하도록 설계. 이 방법은 옥수수 변환에 의존 하지 않는 하지만 미생물 유전학 및 병원 균의 분 비 기능을 악용. 여기, vivo에서의 검사 전달 감염 사이트 및 직물의 다른 종류에서 spatiotemporal 고해상도 단백질 분 비 수 있습니다. 트로이 목마 전략 정도 기능 단백질 도메인, 분석에서 대상 단백질 효과, 또는 온 사 이드 단백질 overdosage를 위한 강력한 도구를 만드는 연구를 특성화 하기 위해 옥수수 기능 손실 고기를 보완 하기 위해 이용 될 수 있다 옥수수 작물 시스템에서 단백질 연구입니다. 이 작품 뒤에 3 개의 다른 옥수수 조직 형식에이 메서드를 적용 하는 표준화 된 감염 프로토콜 트로이 목마 긴장을 생성 하는 방법에 정확한 프로토콜을 포함 합니다.
Introduction
Biotrophic 병원 체 Ustilago maydis 1옥수수 smut 질병 원인이 되는 에이전트입니다. 그것은 모든 공중 부분 melanized, 검은 포자를 포함 하는 큰 종양에 따른 옥수수의 감염. 글로벌 수준에서 미국 maydis 종양 멕시코의 gastronomical 진미로 평가 되는 동안 옥수수 생산량의 약 2%의 연간 손실 발생으로 추정 된다. 식물 감염 옥수수 표 피 세포의 첫 번째 계층에 침투를 lysing 효소 세포 벽을 분 비 하는 appressorium에 의해 시작 됩니다. 1 차 감염 사이트에서 미국 maydis 성장 침 및 intercellularly, 모든 주1,2레이어 1 ~ 2 셀에 침입. 5 일 시 보이는 종양으로 공장 비 대에 성공적인 감염 결과 감염1,,34게시. 모든 감염 단계 곰 팡이 균 invaginate 호스트 세포질1,2에 직접 접촉 하지 않고 공장 세포질 막. 감염 균과 식물 원형질 막 사이 공간을 꽉 apoplasmic biotrophic 상호 작용 영역 이라는 호스트/병원 체 인터랙티브 사이트로 간주 됩니다. 극복 하기 위해 공장 타고 난 면역 계통, 미국 maydis biotrophic 상호 작용 영역1에 effector 단백질의 배열을 은닉 한다. 반면 다른 사람 biotrophic 상호 작용 영역5,6,,78에 어떤 이펙터 식물 세포에 의해 찍힌다. 1 apoplastic 이펙터 UmPit2 신호 펩 티 드 ZmZIP1 ZmPROZIP에서 apoplastic 프로 테아 제 활동9,10의 출시를 방지 하기 위해 옥수수 apoplastic 프로 테아 제와 상호 작용 하는.
지난 십년 동안 미국 maydis 되었다만 식물 병원 체 상호 작용에서 곰 팡이 유전학 뿐만 아니라 생명 공학 파악된 수명 주기, 쉬운 유전 접근 가능성 때문에 귀중 한 도구에 대 한 모델 및 분리 식의 분 비 단백질11,,1213. 모두 기존과 파격적 단백질 분 비에 대 한 신호 posttranslational 수정14의 제어를 허용 결정 되었습니다. 최근, 미국 maydis 트로이 목마 도구 작은, 공부를 해 라15옥수수 단백질 분 비로 고용 되었다. 트로이 목마 접근 작은, 분 비 단백질은 꽃 밥 개발에 관여 하는 ZmMAC1의 기능 분석을 성공적으로 사용 되었다. ZmMAC1 유도 만능 세포 및 세포 운명 명세의 새로 형성된 된 셀15의 periclinal 부문 합니다. 같은 방법으로는 옥수수 손상 관련 된 펩 티 드 ZmZIP1의 생물 학적 기능으로 밝혀졌다. 미국 maydis 귀착되 었 다 ZmZIP1 옥수수 은닉 종양 형성10손상. 따라서, 트로이 목마 접근 방식을 나타내는 단백질도 않는 spatiotemporal 고해상도 현장 연구에 귀중 한 대체 경로 필요 안정적인 옥수수 변환 라인도 함께 조직 침투의 세대 heterologously 표현 및 순화 된 단백질입니다. 특히, 트로이 목마 전략 옥수수 apoplast에 어떤 분리 단백질의 분 비와 같은 조직 내에서 감염 되지 않은 식물 세포 감염 대 의 직접 비교 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 관심사의 단백질을 공부 하는 미국 maydis 트로이 목마 스트레인을 생성 하기 위한 주요 단계를 보여 줍니다. 그것은 더 포함 (성인 잎, 술과 귀) 3 다른 옥수수 조직 유형의 감염 절차에 정확한 정보 미 maydis, spatiotemporal 감염 진행 및 단백질 기능을 공부에 대 한 전제 조건입니다. 이러한 대상 조직. 아니 추가 사양은 옥수수 유전자 증폭에 부여 하 고 있기 때문에 이러한 단계는 특정 대상 및 악기 종속적 기법, 영상 현미경입니다. 따라서,이 프로토콜은 표준 분자 생물학 기술의 숙련 된 사용자에 게 제시 된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현대 작물 연구에서 유전 분자 분석 및 단백질 수준에 대 한 프로토콜을 요구합니다. 유전 접근을 통해 변환 사용할 수 또는 비효율적이 고 옥수수 등 대부분 작물 종에 대 한 시간이 아니다. 또한, 발기인 기자 시스템 등 신뢰할 수 있는 유전 도구 부족, 어려운 별개 조직 사이트에서 고해상도 spatiotemporal 원래의 단백질 기능을 공부 하는. Apoplastic 단백질 조직으로 heterologously 표현 하 고 순화…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 토마스 Dresselhaus, 마틴 Parniske, 누 Djella, 그리고 아 르 민 힐 데 브란트 실험실 공간 및 식물 소재 제공 감사 하 고 싶습니다. 트로이 목마 방법에 원래 작업 Leopoldina postdoc 친교와 NSF 프로젝트 IOS13 39229에 의해 지원 되었다. 이 문서에 제공 된 작업 (프로젝트 A14 및 나사 B14) SFB924 DFG의 지원 했다.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
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