トロイの木馬として経路を用いたトウモロコシ蛋白質場配信で
Summary
この作品は、3 つの異なったタイプのトウモロコシのティッシュに分泌されたトウモロコシ蛋白質の原配信経路トロイの木馬ひずみのクローニングについて説明します。
Abstract
Homer´s トロイの木馬神話に触発され、我々 はトウモロコシの病原体に体内の表現型解析を許可するトウモロコシのアポプラストから分泌されるタンパク質を提供する経路を設計されています。このメソッドは、トウモロコシの変換に依存しないが、微生物遺伝学、病原体の分泌機能を悪用します。ここで、体内の検査感染サイトや組織の異なる種類の高時空間解像度の分泌された蛋白質を配信できます。トロイの木馬戦略は一過性機能的タンパク質ドメイン、オフのターゲット蛋白質の効果を分析したり、オンサイド タンパク質過量投与、それにのための強力なツールを研究を特徴づけるためのトウモロコシの機能喪失の表現型を補完するために利用できます。トウモロコシの収穫システムにおけるタンパク質研究。この作業には、3 種類の異なるトウモロコシ組織にこのメソッドを適用するプロトコルを標準化された感染症に続いてトロイの木馬ひずみが発生する方法の正確なプロトコルが含まれています。
Introduction
赤病原体経路トウモロコシ黒穂病病1の原因となるエージェントです。Melanized、黒い胞子を含む大きな腫瘍でトウモロコシのすべての空中部分に感染します。グローバル レベルで米国アルテリシジンはメキシコで美食珍味として腫瘍を感謝しながらトウモロコシ収量の約 2% の年次損失を引き起こすと推定されます。植物の感染症は、トウモロコシの表皮細胞の最初の層を貫通する細胞壁溶解酵素を分泌する付着器によって開始されます。一次感染サイトから米国アルテリシジン成長細胞内と intercellularly、毎日1,2層 1 ~ 2 セルに侵入します。5 日に目に見える腫瘍に変わる植物の肥大で成功の感染結果感染1,3,4を投稿します。段階すべて感染菌糸はホスト細胞質1,2に任意の直接接触しなくても植物細胞質膜を鞘に収めた。感染菌糸と植物細胞膜間のタイトな apoplasmic スペースは、赤の相互作用ゾーンと呼ばれる宿主・病原体のインタラクティブなサイトと見なされます。植物自然免疫系を克服するためには、米国アルテリシジンは赤相互作用ゾーン1にエフェクター蛋白質の配列を分泌します。他の赤の相互作用ゾーン5,6,7,8のままいくつかのエフェクタの植物細胞にとられます。1 つ細胞壁のエフェクターは、シグナル伝達ペプチド ZmZIP1 ZmPROZIP から細胞壁プロテアーゼ活性9,10のリリースを防ぐためにトウモロコシの細胞壁酵素と相互作用する UmPit2 です。
最後の十年にわたって米国アルテリシジンなった植物-病原菌の相互作用、菌類の遺伝学もバイオ テクノロジー遺伝子手軽周知のライフ サイクルのために貴重なツールのためのモデルだけとの異種発現分泌タンパク質11,12,13。両方の従来型およびタンパク質の分泌のための信号は、翻訳後修飾14の制御を可能に決定されています。最近、米国アルテリシジンは小さい、勉強するトロイの木馬ツール分泌されるその場15トウモロコシ蛋白質として採用されました。トロイの木馬のアプローチは、小さな、分泌された蛋白質は葯の発達に関与する ZmMAC1 の機能を分析する正常に使用されました。ZmMAC1 は、多能性細胞と新しく生まれてくる細胞15の細胞運命仕様の周縁部を誘導します。同じ方法では、トウモロコシの被害関連ペプチド ZmZIP1 の生物学的機能が明らかになった。米国アルテリシジンZmZIP1 は、トウモロコシを分泌障害、腫瘍形成10です。したがって、トロイの木馬のアプローチを表す貴重な代替ルートはどちらも高時空間解像度でその場研究でタンパク質に必要な安定したトウモロコシ変換行もの組織浸潤の世代クローン発現と精製したタンパク質。特に、トロイの木馬戦略は、トウモロコシのアポプラストに任意の異種タンパク質の分泌と同じ組織内にある感染対非感染植物細胞の直接比較をできます。
このプロトコルは興味の蛋白質を調査する米国アルテリシジントロイの木馬歪みを生成するための主な手順を示しています。それさらを含む 3 つの異なるトウモロコシ組織型 (成人の葉、タッセルと耳) の感染対策に関する正確な情報米菌と時空間感染の進行そして蛋白質の機能を研究するための前提条件であります。これらのターゲットのティッシュ。それ以上の仕様は、トウモロコシの遺伝子増幅し顕微鏡イメージング技術、手順、ターゲット特定機器に依存したので。したがって、このプロトコルは、標準的な分子生物学の技術の経験豊富なユーザーに解決されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
現代の作物研究は、遺伝子の分子生物学的解析とタンパク質レベルのプロトコルを要求します。遺伝的アクセシビリティを介して変換はありません利用可能なまたは非効率的でトウモロコシなどほとんどの作物種のため時間がかかるです。また、プロモーター レポーター システムなど信頼性の高い遺伝的ツールが不足している、異なる組織サイトで高時空間解像度でその場でタンパ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ラボ スペースおよび植物材料を提供するためトーマス ドレッセルハウス場、マーティン Parniske、ヌールディン Djella とアーミン ヒルデブラントを感謝したいです。トロイの木馬方式のオリジナル作品は、レオポルジナ ポスドク親睦と NSF プロジェクト IOS13 39229 によって支えられました。この記事で紹介した作品は、DFG の SFB924 (A14 と B14 のプロジェクト) によって支えられました。
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
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