Usando o Ustilago maydis como um cavalo de Troia para em Situ entrega de milho proteínas
Summary
Este trabalho descreve a clonagem de uma estirpe de cavalo de Troia de Ustilago maydis para a entrega no local das proteínas secretadas de milho em três tipos diferentes de tecidos de milho.
Abstract
Inspirado pelo mito de cavalo de Troia Homer´s, nós produzimos o patógeno milho, Ustilago maydis entregar proteínas secretadas para o apoplasto milho permitindo análise fenotípica em vivo. Este método não se baseia na transformação de milho mas explora recursos secretoras de patógenos e genética microbiana. Neste documento, permite a inspeção de in vivo entregue proteínas secretadas com alta resolução spatiotemporal em diferentes tipos de tecidos e infecção sites. A estratégia do cavalo de Troia pode ser utilizada para complementar transitoriamente milho fenótipos de perda-de-função, caracterizar funcionalmente os domínios da proteína, para analisar os efeitos da proteína alvo, ou estudar a sobredosagem de proteína em jogo, tornando-o uma ferramenta poderosa para estudos de proteína no sistema de colheita de milho. Este trabalho contém um protocolo preciso sobre como gerar uma cepa de cavalo de Troia, seguida de protocolos padronizados de infecção para aplicar esse método para três tipos de tecido diferentes de milho.
Introduction
O patógeno biotrófica Ustilago maydis é o agente causador da doença obscenidade milho1. Ele infecta todas as partes aéreas de milho, resultando em tumores grandes que contêm esporos melanized, preto. A nível global, U. maydis é estimado para causar uma perda anual de cerca de 2% do rendimento do milho, enquanto tumores são apreciados como uma iguaria gastronômica no México. Infecção da planta é iniciada por um apressório que secreta enzimas de lise de parede celular para penetrar a primeira camada de células epidérmicas de milho. De um local de infecção primária, U. maydis cresce intracelular e intercellularly, invadindo a célula de uma a duas camadas cada dia1,2. Resultados de infecção bem sucedida na hipertrofia da planta que se transforma em tumores visíveis após cinco dias pós infecção1,3,4. Durante todas as fases da infecção, hifas fúngicas invaginate da membrana do citoplasma de planta sem qualquer contacto directo para o anfitrião citoplasma1,2. O espaço de apoplasmic apertado entre as hifas infectante e a membrana plasmática de planta é considerado a hospedeiro/agente patogénico interativas do site, chamada de zona de interação biotrófica. A fim de superar o sistema imune inato de planta, U. maydis segrega uma matriz de proteínas efetoras para a interação biotrófica zona1. Alguns efetores são ocupados por células vegetais, enquanto os outros permanecem no biotrófica interação zona5,6,7,8. Um efetor apoplástica é UmPit2, que interage com proteases apoplástica milho para impedir a libertação da sinalização do peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplástica protease atividade9,10.
Nas últimas décadas, U. maydis tornou-se não apenas um modelo para a genética de fungosas na interação planta-patógeno, mas também uma ferramenta valiosa na biotecnologia devido a um ciclo de vida bem compreendida, fácil acessibilidade genética e expressão heteróloga de secretado proteínas11,12,13. Foram determinados sinais para ambos secreção de proteína convencional e não convencional que permite o controle de modificações do posttranslational14. Recentemente, U. maydis foi empregado como uma ferramenta de cavalo de Troia para estudar pequeno, secretada milho proteínas em situ15. A abordagem de cavalo de Troia foi usada com sucesso para analisar a função da proteína secretada, pequena ZmMAC1 que está envolvido no desenvolvimento da antera. ZmMAC1 induz a divisão periclinal de células pluripotentes e especificação de destino célula do recém-formado células15. Pelo mesmo método, a função biológica do milho associada a danos peptide ZmZIP1 foi revelada. U. maydis segregar o milho que zmzip1 resultou na deficiente formação de tumor10. Assim, o cavalo de Troia abordagem representa uma valiosa rota alternativa à proteína em situ estudos com alta resolução spatiotemporal que faz nem exigem geração de linhas de transformação de milho estável nem infiltração de tecido com heterologously proteínas expressas e purificadas. Em particular, a estratégia do cavalo de Troia permite a secreção de qualquer proteína heteróloga para o apoplasto milho e comparação direta de infectados contra células não infectadas planta dentro do mesmo tecido.
Este protocolo ilustra as principais etapas para a geração de uma estirpe de cavalo de Troia U. maydis para estudar uma proteína de interesse. Além disso inclui informações precisas sobre os procedimentos de infecção de três tipos de tecido diferentes de milho (folhas adultas, borlas e orelhas) com U. maydis, que é um pré-requisito para estudar a função de progressão e proteína de infecção spatiotemporal nestes tecidos alvo. Sem mais especificações são determinado na amplificação de gene milho e microscópicas de imagens técnicas, uma vez que estas etapas são alvo específico e dependente do instrumento. Assim, o presente protocolo é dirigido aos usuários experientes de técnicas padrão de biologia molecular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pesquisa de cultura moderna exige protocolos de análise molecular, a genética e os níveis de proteína. Genética de acessibilidade através de transformação não é disponível ou ineficiente e demorado para a maioria das espécies de culturas como o milho. Além disso, ferramentas genéticas confiáveis tais como sistemas de repórter do promotor são escassas, o que torna difícil para o estudo da função das proteínas in situ com alta resolução spatiotemporal nos sítios de tecidos distintos. Apopl?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand para fornecer material de espaço e a planta do laboratório. O trabalho original sobre o método de cavalo de Troia foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de Leopoldina e projeto NSF IOS13-39229. O trabalho apresentado neste artigo foi apoiado por SFB924 (projetos A14 e B14) da DFG.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
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