Med hjälp av Ustilago maydis som en trojansk häst för i Situ leverans av majs proteiner
Summary
Detta arbete beskrivs kloning av en Ustilago maydis trojansk häst stam för jordbaserad leverans av utsöndrade majs proteiner in i tre olika typer av majs vävnader.
Abstract
Inspirerad av Homer´s Trojan Häst myt, vi konstruerat majs patogenen Ustilago maydis att leverera utsöndras proteinerna i den majs apoplast möjliggör invivo fenotypiska analys. Denna metod förlitar sig inte på majs omvandling men utnyttjar mikrobiell genetik och sekretoriska funktioner av patogener. Häri, tillåter den inspektion av invivo levereras utsöndrade proteiner med hög spatiotemporal upplösning på olika sorters infektionsställen och vävnader. Trojansk häst strategin kan utnyttjas för att komplettera normalnivå majs förlust-av-funktion fenotyper, för att karakterisera funktionellt protein domäner, att analysera off-target protein effekter, eller att studera onside protein överdosering, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för protein studier i systemet majs gröda. Detta arbete innehåller ett exakt protokoll på hur till generera en trojansk häst stam följt av standardiserade infektion protokoll att tillämpa denna metod på tre olika majs vävnadstyper.
Introduction
Biotrophic patogenen Ustilago maydis är vilka smittämnen av majs smut sjukdom1. Det infekterar alla antenn delar av majs vilket resulterar i stora tumörer som innehåller melanized, svarta sporer. På global nivå bedöms U. maydis orsaka en årlig förlust på omkring 2% av majs avkastning, medan tumörer är uppskattade som en gastronomisk delikatess i Mexiko. Anläggningen infektion initieras av en appressorium som utsöndrar cellväggen lyseringslösning enzymer för att tränga igenom det första lagret av majs epidermala celler. Från en primär infektion webbplats, U. maydis växer intracellulärt och intercellularly, invaderar en till två cell lager varje dag1,2. Framgångsrik infektion resultat i växten hypertrofi som förvandlar till synliga tumörer vid fem dagar efter infektion1,3,4. Under alla faser för infektion invaginate svampinfektion hyfer växt cytoplasman membranet utan direkt kontakt till värd cytoplasman1,2. Snäva apoplasmic utrymmet mellan de infekterande hyfer och växt plasmamembranet anses vara värd/pathogen interaktiva webbplatsen, kallas zonen biotrophic interaktion. För att övervinna det medfödda immunsystemet växt, utsöndrar U. maydis en rad effektor proteiner in i biotrophic interaktion zon1. Vissa effektorer tas upp av växtceller, medan andra förblir i biotrophic interaktion zon5,6,7,8. En apoplastisk effektor är UmPit2, som interagerar med apoplastisk majs proteaser att förhindra utsläpp av signalering peptid ZmZIP1 från ZmPROZIP av apoplastisk proteas aktivitet9,10.
Under de senaste årtiondena, U. maydis blev inte bara en modell för svamp genetik i växt-patogen interaktion, men också ett värdefullt verktyg i bioteknik på grund av en väl förstått livscykel, enkla genetiska tillgänglighet och heterologa uttryck för utsöndras proteiner11,12,13. Signaler för både konventionella och okonventionella protein sekretion har bestämts så att kontroll av posttranslationell ändringar14. Nyligen, U. maydis var anställd som en trojansk häst-verktyg för att studera små, utsöndras majs proteiner i situ15. Metoden trojansk häst har framgångsrikt använts för att analysera funktionen hos små, utsöndrade proteinet ZmMAC1 som är involverad i anther utveckling. ZmMAC1 inducerar periclinal uppdelningen av pluripotenta celler och cell öde specificering av de nybildade celler15. Med samma metod avslöjades den biologiska funktionen av majs skador-associerade peptiden ZmZIP1. U. maydis utsöndrar majsen ZmZIP1 resulterade i försämrad tumör bildandet10. Således, den trojanska häst tillvägagångssätt representerar en värdefull alternativ rutt till protein i situ studier spatiotemporal med hög upplösning som gör varken kräver generation av stabil majs omvandling linjer eller vävnad infiltration med heterologously uttryckt och renade proteiner. I synnerhet kan trojansk häst strategin utsöndringen av något heterologa protein in i majs apoplast och direkt jämförelse av infekterade kontra icke-infekterade växtceller inom samma vävnaden.
Detta protokoll illustrerar de stora steg för att generera en U. maydis trojansk häst stam för att studera ett protein av intresse. Vidare ingår exakt information om infektion förfaranden av tre olika majs vävnadstyper (vuxna blad, Tofsar och öron) med U. maydis, vilket är en förutsättning för att studera funktionen spatiotemporal infektion progression och protein i dessa vävnader. Inga ytterligare specifikationer är given på majs gen förstärkning och mikroskopiska avbildningstekniker, eftersom dessa steg är mål-specifika och instrument-beroende. Sålunda, detta protokoll riktar sig till erfarna användare av standarden molekylärbiologiska tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Moderna gröda forskning kräver protokoll för molekylär analys på genetiska och proteinnivåer. Genetiska tillgänglighet via omvandling är inte tillgänglig eller ineffektivt och tidskrävande för de flesta grödor arter såsom majs. Dessutom är pålitliga genetiska verktyg som arrangören reporter system knappa, vilket gör det svårt att studera jordbaserad proteinfunktion spatiotemporal med hög upplösning på distinkt vävnad platser. Apoplastisk proteiner kan studeras genom infiltration av heterolo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella och Armin Hildebrand för att tillhandahålla lab utrymme och plant material. Det ursprungliga arbetet på metoden trojansk häst stöddes av en Leopoldina postdoc fellowship och NSF projektet IOS13-39229. Det arbete som presenteras i denna artikel stöddes av SFB924 (projekt A14 och B14) av DFGEN.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Biologie du développement. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
