Расширенные микроскопов, которые позволяют быстро и с высоким разрешением изображений, изолированные плазматической мембраны и окружающие внутриклеточных объем, будет представлен. Интеграция спиннинг микроскопии флуоресцирования внутреннее отражение диска и всего в одной установки позволяет жить изображений эксперименты на приобретение высокой ставки до 3.5 сек на стек изображений.
В живых клетках процессы, такие как формирование адгезии включать широкие структурные изменения в плазматической мембраны и внутренних ячейки. Для того, чтобы визуализировать эти весьма динамических событий, были объединены два взаимодополняющих световой микроскопии методы, которые позволяют быстро изображений живых образцов: спиннинг диск микроскопии (SD) для записи объем быстро и с высоким разрешением и полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) для точной локализации и визуализации плазматической мембраны. Всеобъемлющей и полной визуализации протокол будет показан для руководящих через пробоподготовки, калибровки микроскопа, формирования изображений и приобретения, что приводит к многоцветные SD-TIRF живой серии изображений с высоким разрешением пространственно временной. В макросе самостоятельной письменной предусмотрено все необходимое изображение после обработки шаги для создания многомерной живой визуализации наборов данных, т.е. регистрации и сочетание отдельных каналов, с открытым исходным кодом ImageJ. Изображения флуоресцентных белков во время посвящения и созревания адгезии комплексов, а также формирование актина цитоскелета сети, была использована как доказательство принципа для этот новаторский подход. Сочетание 3D микроскопия высокого разрешения и TIRF содержится подробное описание этих сложных процессов в пределах клеточной среды и, в то же время, точной локализации мембраны связанных молекул, обнаружены с высоким Соотношение сигнал фон.
Наших дней, световой микроскопии методы обеспечения высокой/супер резолюции изображений в фиксированной и живой образец быстро развиваются. Суперразрешением методы, такие как стимулировали выбросов истощения (интереса), структурированные освещения микроскопии (SIM) и фото активации локализации микроскопии (PALM) или прямой стохастических оптических реконструкции микроскопии (буря), соответственно, являются коммерчески доступных и включение изображений внутриклеточных структур, показывая детали почти на молекулярном уровне1,2,3,4,5,6. Однако эти подходы имеют ограниченную применимость для живых изображений экспериментов, в которых большие объемы нужно быть визуализированы с несколько кадров в секунду скорость приобретения. Разновидности весьма динамических процессов, регулируется через плазматическую мембрану, например Эндо- / экзоцитоз, адгезии, миграции или сигнализации, происходят с высокой скоростью в пределах крупных сотовых томов. Недавно для того, чтобы заполнить этот пробел, интегрированный микроскопии техника была предлагаемая называется спиннинг диска TIRF (SD-TIRF)7. В деталях TIRF микроскопии позволяет специально изолировать и локализовать плазматической мембраны8,9, в то время как SD микроскопии является одним из наиболее чувствительных и быстро жить методы визуализации для визуализации и отслеживания внутриклеточных органелл в цитоплазме10,11. Сочетание обоих методы визуализации в одиночной установки уже был реализован в прошлом12,13, однако, Микроскоп, представленные здесь (рисунок 1) наконец отвечает критериям для выполнения живых изображений SD-TIRF эксперименты из вышеупомянутых процессов в 3 кадров в секунду скорость. Поскольку этот Микроскоп является коммерчески доступных, цель этой рукописи — описать в деталях и предоставлять открытым исходным кодом инструменты и протоколы для захвата изображений, регистрации и визуализации, связанный с SD-TIRF микроскопии.
Установки на основе инвертированным микроскопом, подключенных к блокам два сканирования через независимых порта – левый порт связан с блоком SD и задней порт блок сканера для TIRF и фото активации / отбеливания экспериментов. До 6 лазеры (405/445/488/515/561/640 Нм) могут быть использованы для возбуждения. Для возбуждения и обнаружения сигнала флуоресценции, либо 100 x / NA1.45 масло или 60 x / NA1.49 масло TIRF цели, соответственно, были заняты. Испускаемого света расколот дихроичное зеркало (561 Нм Лонг Пасс или 514 Нм Лонг pass) и фильтруется различными полосовые фильтры (55 Нм широкий центрированного 525 Нм, 54 Нм широкий центрированного 609 Нм для зеленой и красной флуоресценцией, соответственно) перед двумя EM-CCD камеры Эра. Пожалуйста, обратите внимание, что более подробные технические сведения об установке перечислены в Zobiak и др. 7. в TIRF конфигурации SD блок перемещается из света путь в течение около 0,5 s так, что же две камеры могут быть использованы для обнаружения, позволяя быстрое переключение между двумя визуализации формы, по сравнению с около 1 s, что было сообщено в прошлом13 . Эта функция позволяет одновременное приобретение двойного канала, таким образом 4 канала SD-TIRF изображений на ранее непревзойденную скорость и точность могут быть выполнены. Кроме того выравнивание между SD и TIRF образов ненужной. Выравнивание изображения между двумя камерами, однако, должна проверяться перед началом эксперимента и исправления в случае необходимости. В следующий протокол в макросе самостоятельной письменной ImageJ был реализован обычной регистрации коррекции. Кроме того макрос был главным образом позволяют одновременное визуализация SD – и TIRF наборов данных, несмотря на их различные размерности. Приобретение программного обеспечения, сама не представила эти возможности.
В этом документе было представлено первое успешное осуществление микроскопии SD и TIRF в конфигурации подходит для проведения живых клеток экспериментов и изображений, т.е. приобретение высокой ставки как 2 SD-TIRF стеки изображений в минуту в 3 различными этап позиции, соответствующие ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы сильно благодарю научного сообщества из университета медицинский центр Гамбург-Эппендорф за поддержку нас с образцами для оценки. А именно мы благодарим Sabine Windhorst для NIH3T3 клеток, Андреа Mordhorst для рекламы ЯФП-Vinculin и Рудольф Maren для ЗП-Lifeact.
Microscope and accessories | |||
SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
Cell culture | |||
HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
Plasmids | |||
RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
Software and plugins | |||
VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
ImageJ | Version 1.52c | ||
Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |