Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host
Summary
Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.
Abstract
Ci sono una varietà di strategie che impiegano batteri patogeni di sopravvivere e proliferare una volta all’interno della cellula eucariotica. I cosiddetti ‘citosolici’ patogeni (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) accedere al cytosol delle cellule infette da fisicamente ed enzimaticamente degradare la membrana vacuolar primaria. Una volta nel cytosol, questi agenti patogeni sia proliferano, nonché generano sufficienti forze meccaniche di penetrare la membrana plasmatica della cellula ospite al fine di infettare nuove cellule. Qui, ci mostrano come questa fase terminale del ciclo cellulare infezione di L. monocytogenes (Lm) può essere quantificata da saggi di unità formanti colonie e citometria a flusso e dare esempi di come sia effetto di fattori patogeno-ospite con codifica e questo processo. Mostriamo anche una stretta corrispondenza delle Lm dinamiche di infezione delle cellule coltivate infettate in vitro e quelli delle cellule epatiche derivate da topi infettati in vivo. Questi saggi basati sulla funzione sono relativamente semplici e possono essere facilmente scalati per schermi di alto-rendimento basata su individuazione per modulatori della funzione delle cellule eucariotiche.
Introduction
Modelli sperimentali basati su infezione sono intrinsecamente impegnativi a causa della loro dipendenza dalle condizioni di partenza dello stato di ospite e patogeno, le varie strategie di infezione del patogeno e la difficoltà di attribuzione dell’agente patogeno e host-processi basati basato sui risultati. Il batterio Listeria monocytogenes (Lm) è diventato un agente patogeno ideale per sondare le risposte di difesa ospite a causa della sua trattabilità genetiche e microbiologiche, la strategia di infezione cellulare rapida e processive e relativamente chiaro relazione tra suoi fenotipi di infezione cellulare e organismica livello. L’infezione cellulare di Lm procede attraverso quattro fasi distinte1: (i) l’invasione cellulare che si conclude con Lm essere racchiuso all’interno di un vacuolo; (ii) Lm-diretto la dissoluzione della membrana del vacuolo e rilascio di Lm nel citosol; (iii) replica intracytosolic; e (iv) penetrazione fisica della membrana plasmatica che si traduce in entrambi l’infezione delle cellule direttamente adiacenti (ad esempio in un foglio di epiteliale) o, in cellule solitarie, rilascio di Lm nell’ambiente extracellulare. Ognuna di queste fasi sono promossi da specifici Lm-codificato fattori (denominati «fattori di virulenza») che, quando eliminato, causare difetti di infezione nei modelli animali e cellulari. Questa strategia di infezione generale è stata evoluta indipendentemente da un numero del cosiddetto ‘citosolico’ patogeni2.
Formanti colonie (CFU) unità saggi sono largamente impiegate per valutare sia in vitro (cioè, cellulare) in vivo (cioè, organismica) esiti di infezione. Oltre alla loro alta sensibilità, specialmente per le infezioni in vivo, CFU saggi forniscono una lettura univoca per l’invasione dell’agente patogeno e sopravvivenza/proliferazione intracellulare. Saggi di CFU sono stati ampiamente utilizzati per analizzare Lm sia host determinanti delle cellule che hanno un impatto infezione. Come informativo come questi studi precedenti sono stati per analizzare l’invasione cellulare e intracytosolic replica, CFU saggi non sono, al meglio della nostra conoscenza, stati utilizzati per tenere traccia della quarta fase del processo di infezione Lm : fuga cellulare. Qui, descriviamo relativamente semplici mezzi di fuga come cellulare (in appresso denominato ’emersione’) possono essere monitorati mediante analisi CFU (così come da citometria a flusso) e visualizza esempi di come entrambi fattori patogeno-ospite con codifica e regolano questa fase di Lm ciclo di infezione. L’analisi della fase terminale del ciclo cellulare Lm infezione può rendere possibile identificare l’agente patogeno supplementare e fattori di infezione specifica cellula ospite e attività.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grazie al suo programma di infezione cellulare rapida e processive, Lm è un patogeno ideale per sondare le attività cellulari che hanno un impatto infezione. È stata identificata una serie di fattori dell’ospite che positivamente o negativamente influenzare Lm infezione cellulare11,12,13,14. Due tali host fattori caratterizzati nel nostro laboratorio, perforina-2 e l’inibit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
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