בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם
Summary
אנו מספקים פרוטוקולים להערכה של גזע mesenchymal מבודד מן עיסת שיניים ואינטראקציות התא סרטן הערמונית המבוסס על שיטות תרבות שיתוף ישיר ועקיף. מצב בינוני וממברנות הטרנס-ובכן מתאימים לניתוח פעילות paracrine עקיף. זריעה באופן שונה מוכתמת. בתאים ביחד הוא מודל המתאים לאינטראקציה תא ישירה-cell.
Abstract
סרטן כמו תהליך רב-שלבי המחלה מורכב לא רק מוסדר על ידי התפשטות תאים בודדים וצמיחה אלא גם נשלט על ידי אינטראקציות וסביבה תא-תא הגידול. זיהוי של סרטן ואינטראקציות תאי גזע, לרבות שינויים בסביבה חוץ-תאית, האינטראקציות פיזי וגורמים מופרשים, עשוי לאפשר הגילוי של אפשרויות טיפול חדשות. אנו משלבים תרבות משותפת מוכרת טכניקות ליצירת מערכת מודל עבור גזע mesenchymal (MSCs) וסרטן תא אינטראקציות. במחקר הנוכחי, תאי גזע זולה שיניים (DPSCs) ואינטראקציות התא סרטן הערמונית PC-3 נבדקו על-ידי טכניקות תרבות שיתוף ישיר ועקיף. מצב בינוני (ס מ) המתקבל DPSCs, 0.4 מיקרומטר נקבוביות בגודל הטרנס-ובכן ממברנות שימשו כדי ללמוד paracrine פעילות. תרבות משותפת של סוגי התאים יחד בוצעה ללמוד אינטראקציה ישירה תאים תאים. התוצאות חשף כי ס מ גדל התפשטות תאים, ירד אפופטוזיס תרביות תאים סרטן הערמונית. ס מ ומערכת הטרנס-ובכן גדל תא קיבולת העברה של PC-3 תאים. תאים צבעונית עם צבעי ממברנה שונים היו נזרע לתוך תרבות אותם כלי-דם, והשתתף DPSCs מבנה מאורגן עצמית עם PC-3 תאים תחת תנאי זה תרבות שיתוף ישיר. בסך הכל, התוצאות הראו, כי שיטות חקלאות משותף יכול להיות שימושי עבור סרטן ואינטראקציות MSC כמערכת מודל.
Introduction
גזע mesenchymal (MSCs), עם היכולת של בידול ותרומה רגנרציה של רקמות mesenchymal כגון עצמות, סחוס, שריר, רצועה, גיד שומן, היה מבודד כמעט לכל רקמות הגוף למבוגרים1 , 2. מלבד מתן הומאוסטזיס רקמות על ידי ייצור תאים תושב במקרה של דלקת כרונית או פציעה, הם לייצר ציטוקינים חיוני, גורמי גדילה שננהל אנגיוגנזה, המערכת החיסונית, רקמות שיפוץ3. האינטראקציה של MSCs עם סרטן רקמות לא מובנות, אך ראיות המצטבר מרמז כי MSCs עשוי לקדם את החניכה, התקדמות, גרורות הגידול4.
יכולת ביות של MSCs האזור הפצוע או דלקתי כרוני גורם להם מועמד בעל ערך עבור טיפולים מבוססי תאי גזע. עם זאת, סרטן רקמות, “מעולם לא ריפוי הפצעים”, שחרר גם ציטוקינים דלקתיים מולקולות פרו-אנגיוגנזה, גורמי גדילה חיוני, אשר מושכים MSCs אזור cancerogenous5. יש אמנם מוגבל דוחות מציג מעכבות ההשפעות של MSCs על סרטן הצמיחה6,7, שלהם התקדמות סרטן, גרורות קידום אפקטים כבר נרחב דיווח8. MSCs במישרין או בעקיפין להשפיע carcinogenesis בדרכים שונות, כולל דיכוי תאים חיסוניים, מפריש גורמי גדילה/ציטוקינים התומכים התפשטות תאים סרטן של הגירה, שיפור פעילות האנגיוגנזה, וויסות 9,mesenchymal-אפיתל המעבר (החובשים)10. סביבת הגידול מורכב של מספר סוגי תאים כולל סרטן הקשורים fibroblasts (CAFs) ו/או myofibroblasts, תאי אנדותל, adipocytes של תאים חיסוניים11. מאלה, CAFs הם סוג התא הנפוץ ביותר באזור הגידול להפריש נוגדנים שונים לקידום וצמיחה של גרורות סרטן8. הוכח כי MSCs הנגזרות מח עצם יכולים להתמיין CAFs משתית הגידול12.
תאי גזע זולה שיניים (DPSCs), המאופיינת כמו MSCs הראשון נגזר רקמות שיניים. Gronthos et al. 13 בשנת 2000 ואז נרחב נחקר על-ידי אחרים14,15, אקספרס סמנים pluripotency כגון Oct4, Sox2ו- Nanog16 , יכולים להתמיין תא שונים linages17. ניתוח ביטוי גנים וחלבונים הוכיח כי DPSCs לייצר רמות דומות של גורמי גדילה/ציטוקינים עם אחרים MSCs כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF), angiogenin, פיברובלסט גורם גידול 2 (FGF2), אינטרלויקין-4 (IL-4), IL-6, IL-10, תא גזע פקטור (SCF), כמו גם fms דמוי טירוזין קינאז-3 ליגנד (Flt – 3L) זה עשוי לקדם אנגיוגנזה, לווסת את תאי המערכת החיסונית ולתמוך סרטן התא התפשטות והעברה18,19,20 . בעוד האינטראקציות של MSCs לסביבת סרטן כבר מתועד בספרות, היחס בין DPSCs, תאים סרטניים לא הוערך עדיין. במחקר הנוכחי, הקמנו תרבות משותפת, מצב בינוני טיפול אסטרטגיות עבור קו תא סרטן הערמונית גרורתי מאוד, PC-3 ו- DPSCs להציע פוטנציאל הפעולה של המנגנון של MSCs שיניים התקדמות סרטן, גרורות.
Protocol
Representative Results
Discussion
התרומה של MSCs לסביבת הגידול מוסדר על ידי אינטראקציות מספר כולל היברידית תא דור דרך התא fusions, entosis או ציטוקינים ופעילויות כימוקין בין תאי גזע תאים סרטן28. מבנה הארגון, תא-תא אינטראקציות וגורמים המופרש לקבוע בהתנהגות התא סרטן מבחינת קידום הגידול, התקדמות, גרורות לרקמות. נאות <e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת Yeditepe. כל הנתונים ודמויות להשתמש במאמר זה היו שפורסמו בעבר34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. . Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -. r., et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin’s lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer’s disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. . Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
