Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions
Summary
Nous fournissons des protocoles d’évaluation des cellules souches mésenchymateuses isolées de la pulpe dentaire et interactions cellulaires de cancer de la prostate basées sur des méthodes directes et indirectes de co-culture. Moyenne de l’état et les membranes de trans-puits conviennent d’analyser l’activité paracrine indirecte. Ensemencement différemment colorées cellules ensemble est un modèle approprié pour l’interaction cellule-cellule direct.
Abstract
Cancer comme un processus multipas et compliquées de la maladie est non seulement régi par la croissance et la prolifération des cellules individuelles mais également contrôlé par des interactions entre environnement et cellules de tumeur. Identification du cancer et des interactions entre cellules souches, y compris les changements dans l’environnement extracellulaire, interactions physiques et facteurs sécrétés, pourrait permettre la découverte de nouvelles options thérapeutiques. Nous combinons des techniques de culture co connus pour créer un système modèle pour les cellules souches mésenchymateuses (CSM) et le cancer interactions cellulaires. Dans la présente étude, des cellules souches pulpe dentaire (DPSCs) et les interactions entre les cellules de cancer de la prostate dans la PC-3 ont été examinées par des techniques directes et indirectes de co-culture. Moyen de condition (CM) provenant de DPSCs et 0,4 µm taille de pore trans-puits membranes ont été utilisés pour étudier l’activité paracrine. Co-culture de différents types de cellules ensemble a été réalisée pour étudier les interactions cellule-cellule direct. Les résultats ont révélé que CM augmente la prolifération cellulaire et une diminution de l’apoptose dans les cultures de cellules de cancer de la prostate. Les CM et les trans-puits augmenté capacité de migration des cellules du PC-3 cellules. Cellules colorées avec des teintures différentes membranes ont été ensemencées dans les récipients de culture même, et DPSCs ont participé à une structure auto-organisée avec PC-3 cellules sous cette condition de co-culture direct. Dans l’ensemble, les résultats indiquent que les techniques de culture mixte pourraient être utiles contre le cancer et les interactions de MSC comme système modèle.
Introduction
Cellules souches mésenchymateuses (CSM), avec la capacité de différenciation et de contribution à la régénération des tissus mésenchymateux tels qu’OS, cartilage, muscle, ligament, tendon et adipeux, ont été isolés chez presque tous les tissus dans le corps adulte1 , 2. autre que fournir l’homéostasie tissulaire en produisant des cellules résidentes dans le cas d’une inflammation chronique ou d’une blessure, ils produisent vital cytokines et facteurs de croissance d’orchestrer l’angiogenèse, système immunitaire et tissu transformant3. L’interaction de MSCs avec tissus cancéreux n’est pas bien comprise, mais accumulant suggèrent que MSCs peuvent promouvoir d’initiation, progression et la métastase tumorale4.
La capacité de radioralliement de MSCs vers la zone lésée ou chroniquement enflammée rend un candidat valable pour des thérapies à base de cellules souches. Cependant, les tissus cancéreux, « jamais guérir des blessures », également libérer des cytokines inflammatoires, des molécules pro-angiogénique et vital des facteurs de croissance, qui attirent les MSCs aux cancérogènes zone5. Alors qu’il se limitent rapports montrant les effets inhibiteurs de MSCs sur cancer croissance6,7, leur progression du cancer et les métastases favorisant les effets ont été abondamment rapportés8. MSCs directement ou indirectement atteinte carcinogenèse de différentes façons, y compris la suppression des cellules immunitaires, qui sécrètent des facteurs de croissance/cytokines favorisant la prolifération des cellules cancéreuses et migration, d’améliorer l’activité angiogénique et réglementant transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT)9,10. Environnement de la tumeur se compose de plusieurs types de cellules dont les fibroblastes associés au cancer (CAFs) et/ou myofibroblastes, cellules endothéliales, adipocytes et cellules immunitaires11. Parmi eux, CAFs ya type cellulaire le plus abondant dans la région de tumeur sécrétant divers chimiokines favorisant le cancer la croissance et la métastase8. Il a été démontré que MSCs dérivés de la moelle osseuse peuvent se différencier en CEFA dans le stroma de tumeur12.
Cellules souches pulpe dentaire (DPSCs), caractérisées comme les premières MSCs dérivés de tissus dentaires par Gronthos et al. 13 en 2000 puis largement étudié par d’autres14,15, expriment des marqueurs pluripotence par exemple Oct4, Sox2et Nanog16 et peuvent se différencier en divers cellule Chehalis17. Analyse de l’expression génique et protéique a prouvé que les DPSCs produisent des niveaux comparables de facteurs de croissance/cytokines avec autres MSCs comme facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), angiogenin, facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2), interleukine-4 (IL-4), IL-6, IL-10, et stem cell factor (SCF), en plus de ligand de kinase-3 de fms-like tyrosine (Flt – 3L) qui pourrait promouvoir l’angiogenèse, moduler les cellules immunitaires et d’appuyer le cancer cell la prolifération et la migration18,19,20 . Alors que les interactions de MSCs avec environnement de cancer ont été bien étudiées dans la littérature, la relation entre DPSCs et les cellules cancéreuses n’a pas été évaluée encore. Dans la présente étude, nous avons établi la co-culture et condition des stratégies de traitement moyen pour une lignée cellulaire de cancer de la prostate métastatique hautement, PC-3 et DPSCs propose une action potentielle du mécanisme de MSCs dentaires dans la progression du cancer et des métastases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contribution de MSCs au milieu de la tumeur est régie par plusieurs interactions dont hybride cellulaire génération via cellulaire fusions, entosis ou de cytokines et de chimiokines activités entre les cellules souches et de cellules de cancer du28. Structure de l’organisation, les interactions cellule-cellule et facteurs sécrétés déterminent le comportement de cellule du cancer en termes de promotion tumorale, la progression et la métastase aux tissus avoisinants. Bon ex v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par l’Université Yeditepe. Toutes les données et les chiffres utilisés dans cet article ont été publiées antérieurement34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. . Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -. r., et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin’s lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer’s disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. . Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
