Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner
Summary
Vi leverer protokoller for evaluering af mesenkymale stamceller isoleret fra dental pulp og prostata kræft celle interaktioner baseret på direkte og indirekte Co kultur metoder. Betingelse medium og trans-godt membraner er egnet til at analysere indirekte paracrine aktivitet. Såning varierende er farvede celler sammen en passende model for direkte celle-celle interaktion.
Abstract
Kræft som en omstændelig proces og kompliceret sygdom er ikke kun reguleres ved individuelle celledelingen og vækst men også kontrolleres af tumor miljø og celle-celle interaktioner. Identifikation af kræft og stamceller interaktioner, herunder ændringer i ekstracellulære miljø, fysisk interaktioner og udskilles faktorer, kunne bruges til opdagelsen af nye terapi muligheder. Vi kombinerer kendte Co kultur teknikker for at skabe et modelsystem for mesenchymale stamceller (msc) og kræft celle interaktioner. I den aktuelle undersøgelse, blev dental pulp stamceller (DPSCs) og PC-3 prostata kræft celle interaktioner undersøgt af direkte og indirekte Co kultur teknikker. Betingelse medium (CM) fremstillet af DPSCs og 0,4 µm pore størrelse trans-godt membraner blev brugt til at studere paracrine aktivitet. Fælles kultur af forskellige celletyper blev sammen udført for at studere direkte celle-celle interaktion. Resultaterne viste at CM øget celleproliferation og nedsat apoptose i prostata kræft cellekulturer. Både CM og trans-godt system forøget celle migration kapacitet af PC-3 celler. Celler farves med forskellige membran farvestoffer var seedede i de samme kultur fartøjer, og DPSCs deltog i en selvstændig organiseret struktur med PC-3 celler under denne direkte Co kultur betingelse. Samlet set viste resultaterne, at co kultur teknikker kan være nyttigt for kræft og MSC interaktioner som et modelsystem.
Introduction
Mesenchymale stamceller (msc), med mulighed for differentiering og bidrag til revitalisering af mesenchymale væv såsom knogle, brusk, muskler, ledbånd, senen og fedtholdigt, har været isoleret fra næsten alle væv i voksen krop1 , 2. bortset fra at levere væv homøostase ved at producere bosiddende celler i tilfælde af kronisk betændelse eller en skade, de producerer vitale cytokiner og vækstfaktorer at orkestrere angiogenese, immunsystemet og væv remodellering3. Samspillet mellem MSCs med kræft væv er ikke velforståede, men akkumulere tyder på, at MSC’er kan fremme tumor indledning, progression og metastase4.
MSC’er homing evne til tilskadekomne eller kronisk betændte gør dem en værdifuld kandidat til stamcelle-baseret terapi. Dog, kræft væv, “aldrig healing sår”, også slip inflammatoriske cytokiner, pro-angiogene molekyler og afgørende vækstfaktorer, som tiltrækker MSC’er til cancerogenous område5. Mens der er begrænset rapporteret rapporter viser hæmmende effekter af MSCs på kræft vækst6,7, deres kræft progression og metastase fremme effekter har været flittigt8. MSC’er påvirker direkte eller indirekte carcinogenese på forskellige måder, herunder undertrykke immun celler udskiller vækstfaktorer/cytokiner, der understøtter kræft celleproliferation og migration, forbedring af angiogene aktivitet, og regulering epitel-mesenchymale overgang (EMT)9,10. Tumor miljø består af flere celletyper, herunder kræft-associerede fibroblaster (cafïr) og/eller myofibroblasts, endotel celler, adipocytter og immunceller11. Af dem er cafïr den mest rigelige celletype i området tumor, der udskiller forskellige kemokiner fremme kræft vækst og metastase8. Det har vist sig at knoglemarven-afledte MSCs kan differentiere til cafïr i tumor stroma12.
Dental pulp stamceller (DPSCs), karakteriseret som de første dental væv-afledte MSCs af Gronthos et al. 13 i 2000 og derefter almindeligt undersøges af andre14,15, udtryk pluripotency markører som Oct4, Sox2og Nanog16 og kan udvikle sig til forskellige celle linages17. Gen og protein udtryk analyse viste sig at DPSCs producere sammenlignelige niveauer af vækstfaktorer/cytokiner med andre MSCs som vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), angiogenin, fibroblast vækstfaktor 2 (FGF2), interleukin-4 (IL-4), IL-6, IL-10, og stamceller faktor (SCF), samt fms-lignende tyrosin kinase-3 ligand (Flt – 3L), der kan fremme angiogenese, modulere immunceller og støtte kræft celle spredning og migration18,19,20 . Mens MSCs interaktioner med kræft miljø har været veldokumenteret i litteraturen, er forholdet mellem DPSCs og kræftceller ikke blevet evalueret endnu. I den foreliggende undersøgelse etableret vi fælles kultur og betingelse medium behandling strategier for en yderst metastatisk prostata cancer cellelinie, PC-3 og DPSCs at foreslå potentielle aktioner af mekanisme af dental MSCs i kræft progression og metastaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bidrag af MSC’er til tumor miljø er reguleret af flere interaktioner herunder hybrid celle generation via celle fusioner, entosis eller cytokin og chemokine aktiviteter mellem stamceller og kræft celler28. Strukturelle organisation, celle-celle interaktioner og udskilles faktorer bestemme kræft celle adfærd tumor forfremmelse, progression og metastaser til omkringliggende væv. Ordentlig ex vivo modelsystemer til at undersøge mekanismerne bag samspillet mellem bosiddende cel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Yeditepe Universitet. Alle data og tal, der anvendes i denne artikel var tidligere udgivne34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. . Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -. r., et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin’s lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer’s disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. . Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
