Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties
Summary
Wij bieden protocollen voor evaluatie van mesenchymale stamcellen van tandmerg geïsoleerd en prostaatkanker cel interacties op basis van directe en indirecte co kweekmethoden. Voorwaarde medium en trans-well membranen zijn geschikt voor het analyseren van indirecte paracrine activiteit. Zaaien differentieel is gekleurd cellen samen een passend model voor directe cel-cel interactie.
Abstract
Kanker als meerstaps proces en gecompliceerde ziekte is niet alleen geregeld door individuele celproliferatie en groei maar ook gecontroleerd door tumor milieu en cel interacties. Identificatie van kanker- en stamcellen interacties, met inbegrip van wijzigingen in de extracellulaire omgeving, fysieke interactie en secreted factoren, kan de ontdekking van nieuwe therapie opties inschakelen. Wij combineren de bekende co cultuur technieken om een modelsysteem voor mesenchymale stamcellen (MSCs) en kanker cel interacties maken. In de huidige studie, werden tandmerg stamcellen (DPSCs) en PC-3 prostaatkanker cel interacties onderzocht door directe en indirecte samenwerking cultuur technieken. Voorwaarde medium (CM) verkregen uit DPSCs en 0.4 µm porie formaat trans-well membranen werden gebruikt bij het bestuderen van de paracrine activiteit. Co cultuur van verschillende celtypes werd samen uitgevoerd om te bestuderen van directe cel-cel interactie. De resultaten bleek dat CM verhoogd celproliferatie en daalde van apoptosis in celculturen van prostaatkanker. Zowel CM en trans-well systeem verhoogd cel migratie capaciteit van PC-3 cellen. Cellen met verschillende membraan kleurstoffen gekleurd werden zaadjes in de dezelfde kweekvat, en DPSCs deelgenomen aan een zelf-georganiseerde structuur met PC-3 cellen onder de voorwaarde van deze directe co cultuur. Over het geheel genomen de resultaten aangegeven dat mede cultuur technieken nuttig voor kanker en MSC interacties als een modelsysteem zijn kunnen.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSCs), met de mogelijkheid van differentiatie en bijdrage aan de regeneratie van mesenchymale weefsels zoals botten, kraakbeen, spier, ligament, pees en adipeus, werden geïsoleerd van bijna alle weefsels in het volwassen lichaam1 , 2. dan ter verstrekking van weefsel homeostase door overlegging van de resident cellen in het geval van chronische ontsteking of een letsel, produceren ze vitaal cytokines en groeifactoren te orkestreren angiogenese, immuunsysteem en weefsel remodeling3. De interactie van MSCs met kanker weefsel is niet goed begrepen, maar accumuleren bewijs suggereert dat MSCs tumor initiatie, progressie en metastase4kunnen bevorderen.
Het homing vermogen van MSCs naar de gewonde of chronisch ontstoken gebied maakt hen een waardevolle kandidaat voor stamcel gebaseerde therapieën. Kanker weefsels, “nooit helende wonden”, laat echter ook ontsteking cytokinen, pro-angiogenic moleculen en vitale groeifactoren, die MSCs naar de cancerogenous gebied5 aantrekken. Hoewel er beperkte rapporten waarop remmende effecten van MSCs kanker groei6,7, hun progressie van kanker en metastase bevorderende effecten uitgebreid zijn gemeld8. MSCs direct of indirect van invloed zijn op carcinogenese op verschillende manieren met inbegrip van onderdrukken van immune cellen, afscheidende groeifactoren/cytokines die ondersteuning bieden voor kanker celproliferatie en migratie, verbetering van de angiogenic activiteit en regulering epitheliale-mesenchymale overgang (EMT)9,10. Omgeving van de tumor bestaat uit verschillende celtypen, met inbegrip van kanker-geassocieerde fibroblasten (IGFA) en/of myofibroblasts, endotheliale cellen, adipocytes en immuuncellen11. Voor degenen zijn IGFA het meest voorkomende celtype in het gebied van de tumor die verschillende chemokines bevordering van groei en uitzaaiing van de kanker8afscheiden. Het is aangetoond dat het beenmerg-afgeleide MSCs in IGFA in het stroma tumor12 onderscheiden kunnen.
Tandmerg stamcellen (DPSCs), als de eerste tandheelkundige weefsel afkomstige MSCs gekenmerkt door Gronthos et al. 13 in 2000 en vervolgens grote schaal onderzocht door anderen14,15, express pluripotent markeringen zoals Oct4, Sox2en Nanog16 en kan onderscheid worden gemaakt in verschillende cel linages17. Gen- en eiwit expressie analyse bleek dat DPSCs produceren vergelijkbaar niveau van groeifactoren/cytokinen met andere MSCs zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), de angiogenin, de fibroblast groeifactor 2 (FGF2), interleukine-4 (IL-4), IL-6, IL-10, stamcel factor (SCF), alsmede fms-achtige tyrosine kinase-3 ligand (Flt – 3L) die mogelijk bevorderen van angiogenese, immune cellen moduleren en ondersteunen van kanker cel proliferatie en migratie18,19,20 . Hoewel de interacties van MSCs met kanker milieu goed gedocumenteerd in de literatuur geweest, is de relatie tussen DPSCs en kankercellen niet geëvalueerd nog. In de huidige studie, wij opgericht co cultuur en voorwaarde middellange behandelingsstrategieën voor een zeer uitgezaaide prostaatkanker cellijn, PC-3 en DPSCs voor te stellen van potentiële actie van mechanisme van tandheelkundige MSCs in kanker progressie en metastase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bijdrage van MSCs tumor milieu wordt geregeld door verschillende interacties met inbegrip van hybride cel generatie via cel fusies, entosis of cytokine en chemokinereceptoren activiteiten tussen stamcellen en kanker cellen28. Structurele organisatie, cel-cel interacties en secreted factoren bepalen kanker cel gedrag op het gebied van de bevordering van de tumor, progressie en metastase aan het omliggende weefsel. Goede ex vivo modelsystemen te onderzoeken van de mechanismen achte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door Yeditepe Universiteit. Alle gegevens en cijfers gebruikt in dit artikel werden eerder gepubliceerde34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. . Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -. r., et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin’s lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer’s disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. . Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
