Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner
Summary
Vi tillhandahåller protokoll för kvalitetsbedömning av mesenkymala stamceller isoleras från tandpulpan och prostatacancer cell interaktioner bygger på direkta och indirekta samtidig kultur metoder. Villkor medium och trans-väl membran är lämpliga att analysera indirekta parakrin aktivitet. Seedning differentially är färgade celler tillsammans en lämplig modell för direkta cell-cell interaktioner.
Abstract
Cancer som en utgångsämnet process och komplicerade sjukdom är inte bara regleras av enskilda cellproliferation och tillväxt men också kontrolleras av tumör miljö och cell-cell interaktioner. Identifiering av cancer och stem cell interaktioner, inklusive ändringar i extracellulära miljön, fysiska interaktioner och utsöndrade faktorer, kan möjliggöra upptäckten av nya behandlingsalternativ. Vi kombinerar kända samtidig kultur tekniker för att skapa ett modellsystem för mesenkymala stamceller (MSC) och cancer cell interaktioner. I den aktuella studien undersöktes tandpulpan stamceller (DPSCs) och PC-3 prostatacancer cell interaktioner genom direkta och indirekta samtidig kultur tekniker. Villkor medium (CM) erhålls från DPSCs och 0,4 µm porstorlek storlek trans-väl membran användes för att studera parakrin aktivitet. Samtidig kultur av olika celltyper utfördes tillsammans för att studera direkt cell-cell interaktioner. Resultaten visade att CM ökad cellproliferation och minskade apoptos i prostatacancer cellkulturer. Både CM och trans-väl systemet ökade cell migration kapacitet av PC-3 celler. Celler som färgas med olika membran färgämnen var seedad i de samma odlingskärl och DPSCs deltog i en självorganiserade strukturen med PC-3 celler under detta direkt samarbete kultur tillstånd. Sammantaget visade resultaten att samtidig kultur tekniker kan vara användbar för cancer och MSC interaktioner som modellsystem.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC), med möjlighet till differentiering och bidrag till förnyelse av mesenkymala vävnader såsom ben, brosk, muskler, ligament, senor och adipose, har isolerats från nästan alla vävnader i den vuxna kropp1 , 2. än att tillhandahålla vävnad homeostas genom att producera bosatt celler vid kronisk inflammation eller en skada, de producerar livsviktiga cytokiner och tillväxtfaktorer för att orkestrera angiogenes och immunsystemets vävnad remodeling3. MSCs interaktion med cancer vävnad är inte väl förstått, men ackumulerande bevis antyder att MSCs kan främja tumör initiering, progression och metastaser4.
MSCs målsökande förmåga att skadade eller kroniskt inflammerade området gör dem en värdefull kandidat för stamceller-baserade behandlingar. Men frigöra cancer vävnader, ”aldrig läka sår”, också inflammatoriska cytokiner, proangiogena molekyler och vitala tillväxtfaktorer, som locka MSCs till cancerogenous område5. Medan det finns begränsade rapporterade rapporter visar hämmande effekterna av MSCs på cancer tillväxt6,7, deras cancer progression och metastaser främjande effekter har varit omfattande8. MSCs påverkar direkt eller indirekt carcinogenes på olika sätt inklusive undertrycka immunceller, utsöndrar tillväxtfaktorer/cytokiner som stöder cancer cell spridning och migrering, öka angiogena aktivitet och reglera epitelial-mesenkymala övergången (EMT)9,10. Tumör miljön består av flera celltyper inklusive cancer-associerade fibroblaster (CAFs) eller myofibroblaster, endotelceller, adipocyter och immunceller11. Av dessa är CAFs den vanligast förekommande Celltypen i området tumör som utsöndrar olika chemokiner främjar cancer tillväxt och metastas8. Det har visats att benmärgen-derived MSCs kan differentieras till CAFs i tumör stroma12.
Tandpulpan stamceller (DPSCs), karakteriseras som de första dentala vävnad-derived MSCs av Gronthos et al. 13 år 2000 och sedan allmänt utreds av andra14,15, express pluripotency markörer såsom Oct4, Sox2och Nanog16 och kan differentieras till olika cell linages17. Gen och protein uttryck analys visade att DPSCs producera jämförbara nivåer av tillväxtfaktorer/cytokiner med andra MSCs såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), angiogenin, fibroblast tillväxtfaktor 2 (FGF2), interleukin-4 IL-4, IL-6, IL-10, och stamceller faktor (SCF), samt fms-liknande tyrosin Kinas-3 ligand (Flt – 3L) som kan främja angiogenes, modulera immunceller, och stödja cancer cell spridning och migration18,19,20 . Medan interaktionerna av MSCs med cancer miljö har varit väl dokumenterade i litteraturen, har förhållandet mellan DPSCs och cancerceller inte utvärderats ännu. I den aktuella studien etablerat vi samarbete kultur och skick medium behandlingsstrategier för en mycket metastaserande prostatacancer cell fodrar, PC-3 och DPSCs att föreslå potentiella åtgärder av mekanism av dental MSCs i cancer progression och metastasering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bidrag av MSCs till tumör miljö regleras av flera interaktioner inklusive hybrid cell generation via cell fusioner, entosis eller cytokin och chemokine aktiviteter mellan stamceller och cancer celler28. Strukturella organisationen, cell-cell interaktioner och utsöndrade faktorer avgör cancercellers beteende i form av tumör främjande, progression och metastaser till omgivande vävnad. Ordentlig ex vivo modellsystem att undersöka mekanismerna bakom växelverkan mellan bosatt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Yeditepe universitet. Alla uppgifter och siffror som används i den här artikeln var tidigare publicerade34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. . Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -. r., et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin’s lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer’s disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. . Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
