Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe
Summary
Dieses Protokoll sowohl visuell kommuniziert die Hirnstamm Rückenmark Vorbereitung und klärt die Vorbereitung der Hirnstamm quer Scheiben in umfassender Weise Schritt für Schritt. Es wurde entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erlangung lebensfähiger, lang anhaltender, rhythmisch aktiv Scheiben für die Aufzeichnung von neuronalen Ausgang aus der Atemwege Regionen der Hirnstamm.
Abstract
Säugetier-inspiratorische Rhythmus entsteht aus einem neuronalen Netzwerk in einer Region der Medulla namens der PreBötzinger Komplex (pBC), erzeugt ein Signal fahren die rhythmische Kontraktion der inspiratorischen Muskeln. Rhythmische neuronaler Aktivität in der pBC generiert und trug zu anderen neuronalen Pools zu fahren, die die Muskulatur der Atmung mit verschiedenen Ansätzen, einschließlich en bloc Nerv und quer Scheibe Aufnahmen untersucht werden kann. Jedoch haben bisher veröffentlichte Methoden nicht ausgiebig den Hirnstamm Rückenmark Dissektion Prozess transparent und nachvollziehbar für zukünftige Studien beschrieben. Hier präsentieren wir Ihnen einen umfassenden Überblick über eine Methode verwendet, um reproduzierbar rhythmisch-aktive Hirnstamm Scheiben, enthält die notwendige und hinreichenden neuronale Schaltkreise zur Erzeugung und Übertragung von inspiratorischen Laufwerk geschnitten. Diese Arbeit baut auf früheren Hirnstamm Rückenmark Elektrophysiologie Protokolle, die Wahrscheinlichkeit der Erlangung zuverlässig tragfähiger und rhythmisch-Active Scheiben für die Aufzeichnung von neuronalen Ausgang aus der pBC hypoglossal prämotorischen Neuronen (XII pMN), zu verbessern und Hypoglossal Motoneuronen (XII MN). Die vorliegende Arbeit baut auf früheren veröffentlichten Methoden durch den ausführliche, schrittweise Illustrationen der Dissektion, aus ganze Ratte Pup, in-vitro-Slice XII Würzelchen enthalten.
Introduction
Die Atemwege neuronale Netz der Hirnstamm bietet eine fruchtbare Domain für das Verständnis der allgemeinen Eigenschaften von rhythmischen neuronalen Netzen. Insbesondere ist das Interesse an der Entwicklung des Neugeborenen Nagetier atmen und das Verständnis, wie der Atemrhythmus entwickelt. Dies ist möglicherweise mit einem mehrstufigen Ansatz, darunter in Vivo ganze Tier Plethysmographie, in-vitro-en bloc Nerv Aufnahmen gemacht und in-vitro-schneiden Sie Aufnahmen, die den Atem-Rhythmus-Generator enthalten. Reduktionistische in Vitro En Bloc und Scheibe Aufzeichnungen sind eine vorteilhafte Methode zu verwenden, wenn die Mechanismen hinter Atemwege Rhythmogenesis und neuralen Schaltkreis im Großraum Hirnstamm Rückenmark entwickeln Nagetiere zu verhören. Die Entwicklung Atemwege umfasst ca. 40 Zelltypen, gekennzeichnet durch Brennen Muster, einschließlich derjenigen der zentralen Atemwege1,2. Der zentrale Atemwege Netzwerk umfasst eine Gruppe von rhythmisch aktiven Neuronen befindet sich in der rostral ventrolateralen Medulla1,3. Säugetier-Atemwege Rhythmogenesis entsteht aus einer Autorhythmic lokalisiert Interneuron Netzwerk synchronisiert die komplexe PreBötzinger (pBC) wurde experimentell über Slice und En Bloc-Vorbereitungen des Neugeborenen Säugetieren Hirnstamm-spinalen Schnüre3,4,5,6,7,8. Die Region dient eine ähnliche Funktion wie der Sinusknoten (SA) im Herzen und erzeugt eine inspiratorische Timing-System auf Laufwerk Atmung. Aus der pBC erfolgt die inspiratorische Rhythmus in andere Regionen der Hirnstamm (einschließlich des hypoglossal motor Kerns) und spinale Motor-Pools (z. B. der Phrenicus Motoneuronen, die das Zwerchfell fahren)9.
Rhythmische Aktivität erhalten Sie mit Hirnstamm Rückenmark En Bloc Vorbereitungen oder Scheiben aus einer Vielzahl von Zell-Populationen, einschließlich C3-C5 Nerven Würzelchen, XII Nerven Würzelchen, hypoglossal motor Kern (XII-MN), hypoglossal prämotorischen Neuronen (XII pMN), und die pBC3,10,11,12. Während diese Methoden der Datenerhebung über eine Handvoll Laboratorien erfolgreich waren, sind viele der Protokolle nicht in einer Weise präsentiert, die für neue Forscher betreten des Feldes vollständig reproduzierbar ist. Lebensfähig und rhythmisch aktive En Bloc und Scheibe Vorbereitungen zu erhalten erfordert eine akute Liebe zum Detail durch alle Schritte der Präparation und Scheibe schneiden Protokoll. Frühere Protokolle ausführlich beschreiben die verschiedenen Aufnahme-Verfahren und Elektrophysiologie, doch fehlen Details in der wichtigste Teil der Erlangung einer lebensfähigen Gewebe Zubereitung: Durchführung des Hirnstamm Rückenmark Dissektion und Slice-Verfahrens.
Effizient erhalten eine rhythmisch-aktiv und tragfähige En Bloc oder Slice Vorbereitung Hirnstamm Rückenmark Elektrophysiologie Aufnahmen erfordert, dass alle Schritte korrekt, sorgfältig und zügig durchgeführt werden (in der Regel die ganze Prozedur zusammenhängen hier können in ca. 30 min durchgeführt). Kritische Punkte des Protokolls Hirnstamm Rückenmark Elektrophysiologie, die zuvor nicht gut beschrieben wurde sind die Zerlegung des Nerven Würzelchen und das slicing Verfahren auf der Vibratome. Dieses Protokoll ist die erste, der schrittweise visuelle Kommunikation der Hirnstamm Rückenmark Dissektion für neue Forscher und Experten auf dem Gebiet. Dieses Protokoll erklärt auch gründlich Operationstechniken, Sehenswürdigkeiten und andere Verfahren, künftige Forscher bei der Standardisierung von Scheiben und en bloc Vorbereitungen, um die exakte Schaltung in jedem Experiment gewünscht enthalten. Die hier vorgestellten Verfahren können in Ratte und Maus neugeborenen Welpen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anpassung des Protokolls in einer En-Bloc hier vorgestellten oder Slice Workflow ist vorteilhaft für Labore und Studien, die möchten, nutzen Sie entweder en bloc Hirnstamm Rückenmark und/oder dünn schneiden Vorbereitungen für Elektrophysiologie Aufnahmen. Die Dissektion und Slice Methode vorgestellt, zusammen mit Methoden, die bereits von anderen berichtet17,18,19, ermöglicht reproduzierbare Vorbereitung der robusten und t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P ist ein Empfänger von einem Loma Linda University Summer Undergraduate Research Fellowship.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
