إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة
Summary
هذا البروتوكول على حد سواء بصريا يتصل إعداد الحبل الشوكي الدماغ وتوضح إعداد شرائح عرضية جذع الدماغ بطريقة تدريجية شاملة. أنه صمم لزيادة إمكانية تكرار نتائج وتعزز احتمال الحصول على شرائح قابلة للاستمرار، وطويلة الأمد، إيقاعي نشطة لتسجيل الإخراج العصبية من مناطق الدماغ الجهاز التنفسي.
Abstract
يتم إنشاء إيقاع الشهيقيه الثدييات من شبكة الخلايا العصبية في منطقة لب يسمى preBötzinger في مجمع (pBC)، التي تنتج إشارة القيادة الإيقاعي انكماش العضلات الشهيقيه. النشاط العصبي الإيقاعية المتولدة في لجنة البرنامج والميزانية وإلى تجمعات الخلايا العصبية الأخرى لمحرك الأقراص قد درس عضلات التنفس باستخدام مختلف النهج، بما في ذلك كتلة من الأعصاب التسجيلات والتسجيلات شريحة عرضية. ومع ذلك، أساليب سبق نشرها لا على نطاق واسع وصف عملية تشريح النخاع الشوكي الدماغ بطريقة شفافة واستنساخه للدراسات المستقبلية. هنا، يقدم نظرة شاملة لأسلوب يستخدم لتكاثر قطع شرائح الدماغ النشطة إيقاعي يحتوي على الدوائر العصبية ضرورية وكافية لتوليد ونقل محرك الأقراص الشهيقيه. يستند هذا العمل إلى الحبل الشوكي الدماغ الكهربية البروتوكولات السابقة تعزيز احتمال موثوق بها الحصول على شرائح قابلة للاستمرار وايقاعي نشطة لتسجيل إخراج الخلايا العصبية من لجنة البرنامج والميزانية، الخلايا العصبية premotor hypoglossal (المجنحة الثاني عشر)، و هيبوجلوسال الخلايا العصبية الحركية (بالمليون الثاني عشر). ويتوسع العمل قدم الطرق المنشورة السابقة بتقديم توضيحات مفصلة، خطوة بخطوة للتشريح، من الفئران كله ألجرو، إلى شريحة في المختبر الذي يحتوي على rootlets الثاني عشر.
Introduction
وتوفر الشبكة العصبية الجهاز التنفسي من جذع الدماغ مجال خصبة لفهم الخصائص العامة للشبكات العصبية الإيقاعي. على وجه الخصوص، المصلحة في تطوير القوارض الولدان في التنفس، وفهم كيفية تطور إيقاع التنفس. وهذا قد يكون تم استخدام نهج متعدد المستويات، بما في ذلك فيفو بليثيسموجرافي الحيوان كله، في المختبر كتلة تسجيلات العصبية، وفي المختبر شريحة التسجيلات التي تحتوي على مولد إيقاع التنفس. الاختزالية في المختبر أون الكتلة وشريحة التسجيلات طريقة مفيدة للاستخدام عند استجواب الآليات وراء رهيثموجينيسيس الجهاز التنفسي والدوائر العصبية في منطقة الحبل الشوكي الدماغ النامية القوارض. ويشمل تطوير الجهاز التنفسي تقريبا أنواع الخلايا 40، تتميز بإطلاق النار النمط، بما في ذلك الجهاز التنفسي المركزي1،2. وتشمل الشبكة الجهاز التنفسي وسط مجموعة من الخلايا العصبية نشطة إيقاعي يقع في لب فينترولاتيرال روسترال،من13. يتم إنشاء رهيثموجينيسيس الرئوي الثدييات من أوتورهيثميك إينتيرنيورون الشبكة التي يطلق عليها اسم preBötzinger معقدة (pBC)، التي كانت مترجمة تجريبيا عن طريق التحضير الكتلة شريحة واون من الثدييات حديثي الولادة جذع الدماغ-الشوكي الحبال3،4،،من56،،من78. يؤدي وظيفة مماثلة للعقدة sinoatrial (SA) في القلب هذه المنطقة ويقوم بإنشاء نظام توقيت الشهيقيه للتنفس بالسيارة. ويتم إيقاع الشهيقيه من لجنة البرنامج والميزانية، إلى مناطق أخرى في جذع الدماغ (بما في ذلك نواة موتور hypoglossal) وتجمعات السيارات العمود الفقري (مثل فرنك الخلايا العصبية الحركية التي تدفع الحجاب الحاجز)9.
النشاط الإيقاعي يمكن الحصول عليها باستخدام جذع الدماغ الحبل الشوكي أون الكتلة الاستعدادات أو شرائح من مجموعة متنوعة من السكان الخلية، بما في ذلك C3 C5 العصب rootlets، rootlets العصب الثاني عشر، نواة موتور hypoglossal (بالمليون الثاني عشر)، والخلايا العصبية premotor hypoglossal (ثاني عشر المجنحة)، و لجنة البرنامج والميزانية3،10،،من1112. بينما نجحت هذه أساليب جمع البيانات عبر عدد قليل من المختبرات، العديد من البروتوكولات لا تعرض بطريقة يتم استنساخه بالكامل للباحثين الجديد دخول الميدان. يتطلب الحصول على قابلة للاستمرار وايقاعي نشطة في التحضيرات الكتلة وشريحة اهتمام حاد بالتفصيل من خلال جميع الخطوات للتشريح وبروتوكول قطع شريحة. البروتوكولات السابقة على نطاق واسع تصف مختلف إجراءات التسجيل والكهربية، ولكن تفتقر إلى التفاصيل في الجزء الأكثر أهمية للحصول على إعداد أنسجة قابلة للتطبيق: تنفيذ إجراء تشريح وشريحة الحبل الشوكي جذع الدماغ.
يتطلب كفاءة الحصول على تحضير الكتلة أو شريحة إيقاعي نشطة وقابلة للتطبيق في الحبل الشوكي الدماغ الكهربية تسجيلات إجراء جميع الخطوات بشكل صحيح، بعناية وسرعة (عادة، الإجراء برمته ذات الصلة يمكن أن تكون هنا إجراء حوالي 30 دقيقة). وتشمل النقاط الحرجة البروتوكول الكهربية الحبل الشوكي الدماغ التي قد لا مسبقاً كذلك وصفت تشريح العصب rootlets وإجراء تشريح على فيبرتوم. هذا البروتوكول الأول من التدرجي مرئي تشريح النخاع الشوكي الدماغ جديد من الباحثين والخبراء في هذا المجال. ويوضح هذا البروتوكول أيضا دقة التقنيات الجراحية، والمعالم، وغيرها من الإجراءات لمساعدة الباحثين مستقبلا في توحيد شرائح و كتلة الأعمال التحضيرية لاحتواء الدوائر الدقيقة المطلوبة في كل تجربة. يمكن استخدام الإجراءات المعروضة هنا في الجراء الولدان الجرذ والفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكييف البروتوكول المقدمة هنا إلى كتلة en أو شريحة سير العمل مفيد للمختبرات والدراسات التي تود أن تستخدم أما جذع الدماغ الشوكي كتلة و/أو رقيقة شريحة الأعمال التحضيرية للتسجيلات الكهربية. طريقة التشريح وشريحة عرض، جنبا إلى جنب مع الأساليب التي ذكرت سابقا قبل الآخرين17،?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P هو أحد المستلمين من “زمالة البحوث الجامعية الصيفية جامعة لوما ليندا”.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
