इन विट्रो नियोनेटल रोडेंट ब्रेनथेम-स्पाइनल कॉर्ड और पतले स्लाइस में लयतापूर्वक-सक्रिय की तैयारी
Summary
इस प्रोटोकाल में दोनों दृष्टिहीनता से ब्रेन्हेम-स्पाइनल कॉर्ड तैयार करते हैं और एक व्यापक कदम-दर-कदम पर ब्रेन्हेम अनुप्रस्थ स्लाइस तैयार करने को स्पष्ट करते हैं । यह पुनरुत्पादन में वृद्धि करने के लिए डिज़ाइन किया गया था और व्यावहारिक, लंबे समय तक चलने, लयबद्ध-सक्रिय स्लाइस के श्वसन क्षेत्रों से तंत्रिका उत्पादन रिकॉर्डिंग के लिए प्राप्त करने की संभावना में वृद्धि ।
Abstract
स्तनधारी प्रश्वसन लय मज्जा के एक क्षेत्र में एक न्यूरोनल नेटवर्क से उत्पंन prebötzinger परिसर (pbc) कहा जाता है, जो एक संकेत प्रश्वसन मांसपेशियों के लयबद्ध संकुचन ड्राइविंग पैदा करता है । लयबद्ध तंत्रिका pbc में उत्पंन गतिविधि और अंय न्यूरोनल पूल के लिए ले जाया श्वास की मांसपेशियों को ड्राइव करने के लिए एन ब्लॉक तंत्रिका रिकॉर्डिंग और अनुप्रस्थ स्लाइस रिकॉर्डिंग सहित विभिंन दृष्टिकोणों का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है । हालांकि, पहले से प्रकाशित विधियों बड़े पैमाने पर नहीं बताया है ब्रेनिएम-स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन प्रक्रिया भविष्य के अध्ययनों के लिए एक पारदर्शी और reproducible तरीके से । यहां, हम एक विधि का एक व्यापक सिंहावलोकन प्रस्तुत करने के लिए पुनरुत्पादक-सक्रिय ब्रेनहेम के लिए आवश्यक और पर्याप्त ंयूरोनल circuitry युक्त स्लाइस में कटौती और प्रश्वसन ड्राइव संचारण के लिए इस्तेमाल किया । यह काम पिछले ब्रेनफिन पर बनाता है-रीढ़ की हड्डी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल pbc, हाइपोग्लोसल premotor ंयूरॉंस (बारहवीं pmn) से न्यूरोनल उत्पादन रिकॉर्डिंग के लिए मज़बूती से व्यवहार्य और लयबद्ध-सक्रिय स्लाइस प्राप्त करने की संभावना को बढ़ाने के लिए, और अधोजिह् वा मोटर ंयूरॉंस (XII MN) । प्रस्तुत काम विस्तृत प्रदान करके पिछले प्रकाशित तरीकों पर फैलता है, विच्छेदन के कदम दर कदम चित्र, पूरे चूहे pup से, के लिए बारहवीं rootlets युक्त में विट्रो टुकड़ा ।
Introduction
ब्रेनहेम के श्वसन तंत्रिका नेटवर्क लयबद्ध तंत्रिका नेटवर्क की सामान्य विशेषताओं को समझने के लिए एक उपजाऊ डोमेन प्रदान करता है । विशेष रूप से, ब्याज नवजात कृंतक श्वास और समझ कैसे श्वास लय विकसित के विकास में है । यह एक बहु स्तरीय दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है, सहित vivo पूरे पशु plethysmography में, विट्रो एन ब्लॉक तंत्रिका रिकॉर्डिंग में, और विट्रो स्लाइस रिकॉर्डिंग है कि श्वास ताल जनरेटर होते हैं । विट्रो एन ब्लॉक और स्लाइस रिकॉर्डिंग में Reductionist एक लाभप्रद तरीका है जब श्वसन के पीछे तंत्र से पूछताछ का उपयोग कर रहे है लयथमोजेनेसिस और न्यूरल circuitry के ब्रेनहेम-रीढ़ की हड्डी के विकास के क्षेत्र में रोडेंट्स । विकासशील श्वसन प्रणाली लगभग ४० सेल प्रकार, गोलीबारी पैटर्न की विशेषता, केंद्रीय श्वसन के उन सहित1,2भी शामिल है । केंद्रीय श्वसन नेटवर्क के एक समूह में शामिल है लयकीय सक्रिय ंयूरॉन्स में स्थित रोस्ट्रल ventroपार्श्विक मज्जा1,3. स्तनधारी श्वसन लयतंत्र एक autorhythmic interneuron नेटवर्क से उत्पंन preBötzinger परिसर (pBC), जो दोनों टुकड़ा और एन ब्लॉक नवजात स्तनधारी की तैयारी के माध्यम से प्रायोगिक तौर पर स्थानीयकृत किया गया है करार दिया है ब्रेनो-स्पाइनल डोरियों3,4,5,6,7,8. इस क्षेत्र में एक समान कार्य करने के लिए सिनोअलिताल नोड (एसए) दिल में कार्य करता है और श्वसन ड्राइव करने के लिए एक प्रश्वसन समय प्रणाली उत्पन्न करता है । पीबीसी से, प्रश्वसन ताल (हाइपोग्लोसल मोटर नाभिक सहित) और रीढ़ की हड्डी मोटर पूल (जैसे कि मध्यच्छद मोटर ंयूरॉंस कि डायाफ्राम ड्राइव)9के अंय क्षेत्रों के लिए किया जाता है ।
लयबद्ध गतिविधि को ब्रेंहेम स्पाइनल कॉर्ड एन ब्लॉक तैयारियों या स्लाइस का उपयोग करके सेल की आबादी की एक किस्म से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें C3-C5 तंत्रिका rootlets, बारहवीं तंत्रिका rootlets, हाइपोग्लोसल मोटर नाभिक (XII MN), हाइपोग्लोसल premotor ंयूरॉंस (XII pMN), और पीबीसी3,10,11,12। जबकि डेटा संग्रह के इन तरीकों प्रयोगशालाओं के एक मुट्ठी भर में सफल रहा है, प्रोटोकॉल के कई एक तरह से है कि नए क्षेत्र में प्रवेश शोधकर्ताओं के लिए पूरी तरह से reproducible है में प्रस्तुत नहीं कर रहे हैं । व्यवहार्य और लययोग्य सक्रिय एन ब्लॉक और स्लाइस तैयारी प्राप्त करने के विच्छेदन और स्लाइस काटने प्रोटोकॉल के सभी चरणों के माध्यम से विस्तार के लिए एक तीव्र ध्यान की आवश्यकता है । पिछले प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर विभिंन रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का वर्णन है, अभी तक एक व्यवहार्य ऊतक तैयारी प्राप्त करने का सबसे महत्वपूर्ण भाग में विस्तार की कमी: ब्रेन्हेम-स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन और टुकड़ा प्रक्रिया प्रदर्शन ।
कुशलता से एक लयपूर्ण सक्रिय और व्यवहार्य एन ब्लॉक या स्लाइस तैयारी ब्रेनहेम प्राप्त-रीढ़ की हड्डी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है कि सभी चरणों का सही ढंग से प्रदर्शन किया, ध्यान से, और तेजी से (आमतौर पर, पूरे यहां संबंधित प्रक्रिया हो सकता है लगभग 30 मिनट में प्रदर्शन किया) । ब्रेन्हेम-स्पाइनल कॉर्ड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल है कि पहले अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है के महत्वपूर्ण बिंदुओं तंत्रिका rootlets के विच्छेदन और vibratome पर टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए सबसे पहले पदश: नेत्रहीन दोनों नए शोधकर्ताओं और क्षेत्र में विशेषज्ञों के लिए ब्रेननेम-स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन संवाद है । इस प्रोटोकॉल को भी अच्छी तरह से शल्य तकनीक, स्थलों, और अंय प्रक्रियाओं के मानकीकरण में भविष्य के शोधकर्ताओं की सहायता के लिए स्लाइस और एन ब्लॉक तैयारी सटीक circuitry प्रत्येक प्रयोग में वांछित शामिल बताते हैं । यहां प्रस्तुत प्रक्रियाओं चूहा और माउस दोनों नवजात pups में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक एन ब्लॉक या टुकड़ा कार्यप्रवाह में यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल Adapting प्रयोगशालाओं और अध्ययन है कि या तो एन ब्लॉक ब्रेनन-रीढ़ की हड्डी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए पतले स्लाइस तैयारी का उपय?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एस. बी. पी एक Loma लिंडा विश्वविद्यालय ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है ।
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
