リズミカルにアクティブな準備体外新生児齧歯動物脳幹-脊髄損傷で薄くスライス
Summary
このプロトコル両方視覚脳幹脊髄標本を通信し、包括的なステップバイ ステップの方法で脳幹横スライスの準備を明確にします。それは、再現性を高め、脳幹の呼吸の地域から神経の出力を記録するための実行可能な長期的なリズミカル-アクティブのスライスを得ることの可能性を高めるために設計されました。
Abstract
哺乳類の呼吸のリズムは、髄質の複雑な preBötzinger を呼ばれる (pBC)、吸息筋のリズミカルな収縮を駆動信号を生成する領域の神経ネットワークから生成されます。リズミカルな神経活動は pBC で生成され、呼吸筋は、en のブロック神経録音横スライスの録音など、様々 なアプローチを使用して学ぶことができるドライブに他の神経細胞のプールに行った。ただし、以前に公開されたメソッドがない広範囲プロセスを説明脳幹 – 脊髄解離将来研究のための透明性と再現性のある方法で。ここでは、再現性をもって発生し、吸気ドライブを送信するための必要かつ十分な神経回路を含むリズミカル アクティブ脳幹スライスをカットするために使用法の包括的な概要を提案します。この作品は pBC、舌下神経 (XII pMN) 核ニューロンからニューロンの出力を記録するための現実的かつリズミカルにアクティブなスライスを確実に得られる可能性を高めるために前の脳幹 – 脊髄電気生理学のプロトコル上に構築し、舌下神経運動ニューロン (XII MN)。作品発表は、XII 根を含むスライスを全体のラットの子犬から、解剖の詳細なステップバイ ステップのイラストを提供することによって以前の公開メソッドを拡張します。
Introduction
脳幹の呼吸のニューラル ネットワークは、リズミカルなニューラル ネットワークの一般的な特徴を理解するための肥沃なドメインを提供します。特に、関心は新生児齧歯動物呼吸と呼吸のリズムを開発する方法を理解することの開発中です。これは生体全体の動物脈、体外で en のブロック神経録音を含むマルチレベルのアプローチを使用して行われ、体外、呼吸リズム ジェネレーターを含む録音をスライスします。体外 en のブロックおよびスライスの録音での還元は、呼吸器 rhythmogenesis および齧歯動物の開発の脳幹 – 脊髄領域における神経回路の背後にあるメカニズムを問い合わせるときに使用する有利な方法です。発展途上の呼吸器系には、約 40 のセルタイプ、中央呼吸1,2のそれらを含むパターンを発射することによって特徴づけられるが含まれています。中央呼吸ネットワークには腹吻側の延髄1,3にあるリズミカルに活発に神経細胞のグループが含まれます。哺乳類の呼吸 rhythmogenesis が生成されます、autorhythmic からの介在ネットワーク複雑な preBötzinger と呼ばれる (pBC) されているローカライズ実験を介して新生児の哺乳類のスライスと en の両方のブロックの準備脳幹・脊髄の3,4,5,6,7,8 をコードします。この地域は、心臓の洞房結節 (SA) と同様の機能を提供していて、ドライブ呼吸の吸気タイミング システムを生成します。PBC から吸気のリズムは (舌下神経の運動核を含む) 脳幹と脊髄のモーター プール (横隔膜の運動ニューロンでダイアフラムを駆動する) など9の他の地域に運ばれます。
律動は脳幹脊髄 en bloc 準備またはさまざまな C3 C5 神経根、XII 神経根を含む細胞集団からスライスを使用して得られる可能性があります (XII MN) 舌下神経運動核、舌下神経核ニューロン (XII pMN) と10,3,1211,pBC。データ コレクションのこれらのメソッドは、研究所の握りを成功されているが、多くのプロトコル フィールドに入る新たな研究者の完全に再現性のある方法で表示されません。現実的かつリズミカルにアクティブな en ブロックやスライスの準備を取得すると、郭清とスライス切断プロトコルのすべてのステップを通じて、細部への急性の注意が必要です。まだ以前のプロトコルは、広く様々 なレコーディング手順や電気生理学に記述可能なティッシュの準備を得ることの最も重要な部分の詳細を欠いている: 脳幹 – 脊髄の解剖とスライスの手順を実行します。
脳幹 – 脊髄電気生理学録音リズミカルにアクティブと実行可能なアンのブロックやスライスの準備を効率よく取得すべての手順が正しく、慎重に、かつ迅速に実行することが必要です (通常、全体の手順関連ここですることができます約 30 分で実行されます)。ない記載されている以前も脳幹 – 脊髄電気生理学プロトコルの重要なポイントは、神経根と、vibratome のスライスのプロシージャの郭清を含まれます。このプロトコルは段階的に最初は視覚的に新たな研究の分野での専門家脳幹 – 脊髄の解剖を伝えます。このプロトコルはまた徹底的に手術手技、ランドマーク、およびスライスとen のブロックの各実験に必要な正確な回路が含まれて準備を標準化することで未来の研究者を支援するために他の手順をについて説明します。ここで説明されている手順は、ラットおよびマウスの新生仔に使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
En bloc にここに示すプロトコルの適応またはスライス ワークフローが研究所に有利、どちらか en のブロック脳幹 – 脊髄を利用および/または薄いしたい研究スライス電気生理学の録音のための準備。郭清とスライス方法提示、17,18,19以前他の報告方法を組み合わせる、堅牢かつ実行可能な組織とは、範囲に広く適応可能の?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P は、Loma リンダ大学夏学部研究員の受信者であります。
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
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