Beredning av rytmiskt aktiva i Vitro Neonatal gnagare hjärnstammen-ryggmärgen och tunn skiva
Summary
Detta protokoll både visuellt kommunicerar hjärnstammen-ryggmärgen beredning och klargör utarbetandet av hjärnstammen tvärgående skivor på ett omfattande steg för steg sätt. Den var avsedd att öka reproducerbarhet och öka sannolikheten för att få livskraftiga, långvarig, rytmiskt aktiva skivor för inspelning av neurala utdata från de respiratoriska områdena i hjärnstammen.
Abstract
Däggdjur inspiratorisk rytm genereras från ett neuronala nätverk i en region i medulla kallas preBötzinger komplex (pBC), som producerar en signal körning inspiratorisk musklernas rytmiska sammandragning. Rytmiska neural aktivitet genereras i pBC och transporteras till andra neuronala pooler att köra muskulaturn av andning kan studeras med hjälp av olika metoder, inklusive klump nerv inspelningar och tvärgående segment inspelningar. Dock har tidigare publicerade metoder inte utförligt beskrivs processen hjärnstammen-ryggmärgen dissektion i ett öppet och reproducerbart sätt för framtida studier. Här presenterar vi en omfattande översikt av en metod som används reproducibly skära rytmiskt aktiva hjärnstammen skivor som innehåller de nödvändiga och tillräckliga neuronala kretsen för genererandet och sändandet av inspiratorisk drive. Detta arbete bygger på tidigare hjärnstammen-ryggmärgen elektrofysiologi protokoll att öka sannolikheten för att tillförlitligt få livskraftiga och rytmiskt aktiva skivor för inspelning av neuronala utdata från pBC, hypoglossus premotor nervceller (XII pMN), och hypoglossus motoriska nervceller (XII MN). Det arbete som presenteras expanderar på tidigare publicerade metoder genom att tillhandahålla detaljerad, steg för steg-illustrationer av dissektion, från hela råtta pup, att in vitro-skiva som innehåller de XII rottrådar.
Introduction
Respiratoriska neurala nätverk av hjärnstammen ger en bördig domän för att förstå de allmänna egenskaperna hos rytmiska neurala nätverk. Intresset är särskilt i utvecklingen av neonatal gnagare andas och förstå hur andning rytm framkallar. Detta kan vara klar med en multi-level tillvägagångssätt, inklusive i vivo hela djur pletysmografi, in vitro-klump nerv inspelningar, och in vitro-skiva inspelningar som innehåller andning rytm generatorn. Reduktionistiska i vitro sv bloc och segment inspelningar är en fördelaktig metod att använda när förhör mekanismerna bakom respiratorisk rhythmogenesis och neurala kretsar i hjärnstammen-ryggmärgen regionen utveckla gnagare. Utveckla andningsorganen omfattar cirka 40 celltyper, kännetecknas av bränning mönster, däribland de centrala luftvägarna1,2. Det centrala luftvägarna nätverket ingår en grupp av rytmiskt aktiva nervceller som ligger i rostralt ventrolaterala medulla1,3. Däggdjur respiratoriska rhythmogenesis genereras från en autorhythmic interneuron nätverk dubbade den komplexa preBötzinger (pBC), som har varit lokaliserade experimentellt via både skiva och en bloc preparat av neonatal däggdjurs hjärnstammen-spinal sladdar3,4,5,6,7,8. Denna region fyller en liknande funktion till noden sinoatrial (SA) i hjärtat och genererar en inspiratorisk tidtagningssystem till drive respiration. Från pBC bärs inspiratorisk rytmen till andra regioner av hjärnstammen (inklusive hypoglossus motorn kärnan) och spinal motor pooler (såsom de phrenic motoriska nervceller som driver membranet)9.
Rytmisk aktivitet kan erhållas med hjälp av hjärnstammen ryggmärgen sv bloc beredningar eller skivor från en mängd olika cellpopulationer, inklusive C3-C5 nerve rottrådar, XII nerv rottrådar, hypoglossus motorn kärnan (XII MN), hypoglossus premotor nervceller (XII pMN), och pBC3,10,11,12. Medan dessa metoder för datainsamling har varit framgångsrika över en handfull laboratorier, är många av protokoll som inte presenteras på ett sätt som är fullt reproducerbart för nya forskare in i området. Att få livskraftiga och rytmiskt aktiva en bloc och skiva preparat kräver en akut uppmärksamhet till detalj genom alla steg av dissektion och slice skärande protocol. Tidigare protokoll utförligt beskriva de olika inspelningsprocedurer och elektrofysiologi, men saknar detalj i den mest kritiska delen för att få en livskraftig vävnad förberedelse: utföra hjärnstammen-ryggmärgen dissektion och skiva procedur.
Effektivt att erhålla en rytmiskt aktiva och livskraftig sv bloc eller slice beredning hjärnstammen-ryggmärgen elektrofysiologi inspelningar kräver att alla åtgärder utföras korrekt, noggrant och snabbt (vanligtvis hela förfarandet relaterade här kan vara som utförs i ca 30 min). Kritiska punkter i hjärnstammen-ryggmärgen elektrofysiologi protokollet som inte tidigare väl beskrivits inkluderar dissektion av nerv rottrådar och skivning förfarandet på vibratome. Detta protokoll är först att stegvis visuellt kommunicera hjärnstammen-ryggmärgen dissektion för både nya forskare och experter på området. Detta protokoll förklarar också grundligt kirurgiska tekniker, sevärdheter och andra förfaranden för att hjälpa framtida forskare att standardisera skivor och klump preparat innehåller den exakta kretsar som önskas i varje experiment. De förfaranden som presenteras här kan användas i både råtta och mus neonatala valpar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anpassa protokollet presenteras här i ett eget block eller slice arbetsflöde är fördelaktigt för laboratorier och studier som skulle vilja utnyttja antingen klump hjärnstammen-ryggmärgen och/eller tunn skiva preparat för elektrofysiologi inspelningar. Metoden dissektion och skiva fram, kombinerat med metoder som tidigare rapporterats av andra17,18,19, kommer att möjliggöra reproducerbar förberedelse av robust och livs…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P är en mottagare av en Loma Linda University sommaren Grundutbildning Research Fellowship.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
