Summary
يوضح هذا المقالة التقنية لتوسيع حصيرة نانوفيبير اليكتروسبون (2D) التقليدية، والبعد الثاني في سقالة (3D) 3-بعد عن طريق تنفيسها السائل2 CO دون الحرجة. هذه السقالات زيادة 3D، الرموز نانوتوبوجرافيك الخلوية تقليد عن كثب، والحفاظ على وظائف الجزيئات البيولوجية مغلفة داخل النانو.
Abstract
وقد اليكتروسبينينج هذه التكنولوجيا المفضلة في إنتاج سقالة الاصطناعية، والوظيفية بسبب بيوميميكري للمصفوفة خارج الخلية وسهولة السيطرة على تكوين وهيكل، وقطرها من الألياف. ومع ذلك، على الرغم من هذه المزايا، نانوفيبير اليكتروسبون التقليدية السقالات تأتي مع القيود بما في ذلك مشوش المسامية منخفضة وحجم المسام الصغيرة، التوجه نانوفيبير والحصير أساسا ثنائي الأبعاد. على هذا النحو، هناك حاجة ماسة لتطوير عملية جديدة لاختلاق السقالات نانوفيبير اليكتروسبون أنه يمكن التغلب على القيود المذكورة أعلاه. ويرد هنا، طريقة مبتكرة وبسيطة. حصيرة نانوفيبير 2D تقليدية تتحول سقالة 3D مع سمك المرجوة ومسافة الفجوة، المسامية والعظة نانوتوبوجرافيك للسماح للخلية البذر والانتشار من خلال تنفيسها السائل2 CO دون الحرجة. بالإضافة إلى توفير سقالة لتجديد الأنسجة تحدث، يوفر هذا الأسلوب أيضا الفرصة لتغليف الجزيئات النشطة بيولوجيا مثل الببتيدات المضادة للميكروبات لإيصال الأدوية المحلية. السقالات nanofiber2 توسع شركة إمكانات كبيرة في تجديد الأنسجة والتئام الجروح والأنسجة 3D النمذجة وإيصال الأدوية الموضعية.
Introduction
مفهوم تطوير سقالة اصطناعية التي يمكن زرعها في المرضى للمساعدة في إصلاح الأنسجة والتجديد هو الذي قد ساد ميدان الطب التجديدي لعدة عقود. سقالة اصطناعية مثاليا يخدم للحث على الهجرة الخلية من الأنسجة السليمة المحيطة، ويوفر بنية للخلية البذر والالتصاق وإشارات، وانتشار والتمايز، تدعم الأوعية الدموية، يسمح للأوكسجين الكافي و إيصال التغذية، ويعزز النشاط المناعي المضيفة لضمان نجاح بعد غرس1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامه كناقل لتضمين الجزيئات المضادة للميكروبات لمساعدة في الجرح الشفاء1،3،،من67،،من89. القدرة على التحكم في إطلاق هذه الجزيئات البيولوجية الزمانية من سقالة اصطناعية هي سمة مرغوب فيه آخر أن يعتبر عندما السقالات الهندسة1.
وقد تم اليكتروسبينينج تقنية استخداماً جيدا لإنتاج السقالات نانوفيبير1،3،2،4،،من56. وأجريت محاولات سابقة لإنشاء سقالة نانوفيبير مثل تلك التي تمت مناقشتها هنا بدرجات متفاوتة من النجاح. ومع ذلك، محدودة السقالات nanofiber التقليدية قدرات لتحقيق هذه الأهداف. وقد السقالات nanofiber التقليدية معظمهم الحصير ثنائي الأبعاد1،3. هذه السقالات نونيكسبانديد هي المزدحمة مع أحجام المسام الصغيرة؛ وهذا يحصر تسلل خلية، والهجرة، والتمايز كما أنها لا تعزز بيئة ما يكفي من مشابهة لتلك الموجودة في فيفو8،7،،من19. ولهذا السبب، تم إنشاء أحدث تقنيات إعداد السقالة نانوفيبير اليكتروسبون 3D لتعديل العيوب المتأصلة التي تأتي مع ماتس نانوفيبير 2D. تؤدي هذه التقنيات في السقالات 3D؛ ومع ذلك، محدودة الانطباق بسبب أساليب الإنتاج التي تتطلب المحاليل وإجراءات التجميد. نتائج هذه المعالجة في التوزيع العشوائي للنانو دون المنظمة مقيدة، سمك مناسب، و/أو المسامية المطلوب تقديم العظة نانوتوبوجرافيك الكافية اللازمة للهجرة الخلية وانتشار. هذه العوامل تؤدي السقالات نانوفيبير اليكتروسبون 3D السابقة التي تفتقر إلى تقليد الكافية للمعيشة الأنسجة1،7،،من89.
تم إجراء محاولات أكثر حداثة في تطوير سقالة الموسعة، 3D مع بيوميميكري أفضل من المصفوفة خارج الخلية (ECM) استخدام إجراء معالجة حل بورهيدريد (نأبه4) صوديوم مائية والقوالب المصممة مسبقاً للمساعدة في مراقبة أفضل شكل الناتج عن سقالة7،8. ومع ذلك، هذا الأسلوب غير مثالية حيث أنها تتطلب استخدام المحاليل والتفاعلات الكيميائية، والتجميد التي قد تتداخل مع البوليمرات وأي الجزيئات الحيوية المغلفة التي للذوبان في الماء. الإضافات المستخدمة قد يسبب أيضا تأثيرات جانبية خلال الأنسجة التجدد8،9. CO2 التوسع في الأسلوب المبين في هذه المادة إلى حد كبير يقلل من الوقت اللازم للتجهيز ويلغي الحاجة للمحاليل، ويحافظ على المبلغ ووظيفة الجزيئات النشطة بيولوجيا بقدر أكبر مما السابق 9من الأساليب المتبعة.
في الدراسات السابقة والمضادات الحيوية، والفضة، 1α، 25 ديهيدروكسيفيتامين د3ومضادات الميكروبات الببتيد ليرة لبنانية-37 تم تحميلها في السقالات nanofiber منفردة ومجتمعة لإمكانات هذه السقالات للإفراج عن وكلاء للتحقيق زيادة المعونة في الجرح الشفاء9،10،،من1213. غرض إثبات هذا الأسلوب لتوسيع سقالة nanofiber، سيتم تحميل كومارن 6، صبغة فلورسنت، في سقالة تثبت إمكانية تضمين السقالة مع مختلف المركبات المطلوبة. هذا الأسلوب من تلفيق سقالة nanofiber الموسعة بالاقتران مع الجزيئات النشطة بيولوجيا مغلفة يحمل إمكانيات كبيرة لتجديد الأنسجة والتئام الجروح، وإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد من الأنسجة وإيصال الأدوية الموضعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة في فيفو الإجراءات المبينة أدناه بموافقة "اللجنة إياكوك" في المركز الطبي في جامعة نبراسكا.
1. إعداد الحلول لمعيار اليكتروسبينينج
- في أنبوب زجاج 20 مل، حل ز 2 من poly(ε-caprolactone) (PCL، Mw = كاتشين 80) في خليط المذيبات من الميثان (DCM) و N، N-dimethylformamide (DMF) بحصة 4:1 (v/v) بتركيز 10% (w/v).
تنبيه: مقبض DCM و DMF في غطاء جيد التهوية لتجنب التعرض للأبخرة. لا تعرض DCM للمواد البلاستيكية. - ضع أنبوب الزجاج إلى دوار مختبر حتى يصبح الحل واضح. الحل قد خلط بين عشية وضحاها.
- إذا كانت تنوي تضمين المواد النشطة بيولوجيا مثل الببتيدات أو المخدرات إلى السقالة، إنشاء حل منفصل وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
- تحضير صبغة الفلورسنت الحل (50 ملغم/مل) باستخدام 20 مل من محلول PCL.
2. قم بإعداد الجهاز اليكتروسبينينج (الشكل 1A)
- إضافة حل PCL إلى 20 مل حقنه بإبرة حادة قياس 21 يعلق. تأكد من أنه لا يوجد أي هواء في الحقن والأنابيب المرتبطة بها.
- وضع اسطوانة الصلب الدورية مع الأرض وجامع 12 سم من طرف الإبرة.
- استخدام مقاطع التمساح، توصيل إمدادات الطاقة "عالية الجهد التيار المباشر" (DC) بالإبرة والتأكد من أن يستند إلى جامع.
تنبيه: إيقاف دائماً في التيار الكهربائي قبل التعامل مع أي مواد متصلة.
3-اليكتروسبينينج
- لمل 20 من حل PCL، تعيين معلمات مضخة الحقن على النحو التالي: القطر = 20.27 مم، معدل التدفق = 0.5 مل/حاء الاختيار إذا هي تشكيل القطرات في غيض الإبرة.
- إذا كان المطلوب هو إدماج الجزيئات النشطة بيولوجيا، قم بإعداد الجهاز للسماح اليكتروسبينينج co-المحوري (الشكل 1B). إنشاء فوهة محوري مخصصة باستخدام الإبر إبر.
ملاحظة: هذه الفتحات أيضا متاح تجارياً. علما بأن حل لصبغ مستعدة لمحاكاة إضافة مثل هذه الجزيئات.- تعد حلاً 1% من صبغة الفلورسنت 6 الكومارين في المياه. أضف 3 مل الصبغة 1% للمحاقن صغيرة. قم بتوصيل المحاقن فوهة متحد المحور نفسه كحل PCL. مرة أخرى، تأكد أن هناك لا فقاعات الهواء.
- لهذا الحل 3 مل، تعيين معلمات مضخة الحقن على النحو التالي: القطر = 9.49 مم، معدل التدفق = 0.02 مل/حاء الاختيار إذا هي تشكيل القطرات في غيض الإبرة.
- تطبيق الجهد الكهربائي من 20 كيلوفولت بين مغزال (22-قياس الإبرة) وجامع أرض يقع 20 سم بعيداً عن مغزال. جمع الحصير nanofiber المنحازة في اسطوانة دوارة 2,000 لفة في الدقيقة. جمع الحصير nanofiber PCL بمجرد أن تصل إلى سمك ~ 1 ملم.
4-توليد PCL Nanofiber الحصير مع ثقوب صفت.
- اختﻻق ماتس nanofiber PCL.
- حل الخرز PCL في خليط المذيبات يتكون DCM و DMF بنسبة 4:1(v/v) بتركيز 10% (PCL) (w/v). مضخة الحل PCL بمعدل تدفق 0.7 مل/ساعة باستخدام مضخة الحقن بينما محتملة 20 كيلوفولت ويطبق بين مغزال (إبرة غيج 22) وجامع أسس الموقع 12 سم وبصرف النظر عن مغزال.
- جمع الغشاء nanofiber استخدام طبل الدورية مع الدورية بسرعة أكبر من 500 لفة في الدقيقة.
- تزج ماتس nanofiber PCL في سائل ن2 لمدة 5 دقائق (أي.، تصبح قاسية). الاحتفاظ الحصير nanofiber PCL في سائل ن2 ولكمه ماتس nanofiber PCL مع 0.5 مم لكمه.
5-التوسع في 2D Nanofiber الحصير مع أو بدون ثقوب صفت عبر شركة الحرجة2 السائل (الشكل 2).
- مكان ماتس nanofiber PCL في النتروجين السائل لمدة 5 دقائق ومقطعة مربعات 1 سم × 1 سم استخدام مقص جراحي حاد بينما أغرقت في النتروجين السائل لتجنب تشوه الحواف.
- وضع حصيرة قطع في أنبوب الطرد مركزي 30 مل مع ~ 1 g ثلج الجاف. محكم الغطاء الغطاء والسماح للجليد الجاف لتغيير إلى السائل CO2.
- مرة واحدة وقد شكلت السائل في الأنبوب، بسرعة الإفراج عن الضغط عن طريق فتح الغطاء.
تحذير: استخدام معدات الوقاية الحرارية المناسبة عند العمل باستخدام النتروجين السائل والثلج الجاف. لا تقم بفتح أنبوب الضغط نحو الوجه. لا ينبغي أن تستخدم أنبوب الطرد المركزي مرارا وتكرارا. - إزالة ومراقبة سقالة ينفخ من الأنبوب. ضع السقالة في أنبوب الطرد مركزي جديدة مع الثلج الجاف، وكرر حتى يتم تحقيق السمك المطلوب. تعقيم السقالات nanofiber الموسعة في أكسيد الإيثيلين قبل الحضانة مع الخلايا.
6-توصيف السقالات Nanofiber الموسعة
- تميز في مورفولوجيا وهيكل السقالات nanofiber الموسعة باستخدام المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM).
- وضع العينات مع الشريط موصلة على الوجهين بمسمار معدني ومعطف مع البلاتين 40 s استخدام المغطى الرش في 40 اماه.
- دراسة الألياف باستخدام SEM وفقا للدراسات السابقة9. جمع الصور في جهد متسارع من 15 كيلو فولت.
- تميز في المختبر الإفراج عن التشكيلات الجانبية وبيواكتيفيتي من الببتيدات المفرج عنهم.
- الوزن 10 ملغ nanofiber الأغشية قبل وبعد التوسع في CO2.
- تزج العينات في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني وجمع 10 ميكروليتر من المادة طافية في نقاط زمنية مختلفة (0-28 يوما).
- استخدام أدوات المقايسة المناعية مسيل Enzyme-Linked (ELISA) لقياس تركيز الببتيد ليرة لبنانية-37 في جمع المادة طافية.
- دراسة استجابة تسلل الخلوية في فيفو والمضيف.
- وضع الفئران سبراغ داولي (SD) 9-الأسبوع القديمة في تشكيل غرفة تخدير والاتصال بالبخار إيسوفلوراني وتخدير الفئران. نقل الفئران إلى جدول تشغيل بعد أن أصبحت الفئران التخدير الكامل دون مشاعر. تخدير باستمرار على الفئران باستخدام مخروط آنف isoflurane مع المبخر أثناء الجراحة. حلاقة شعر ظهورهم في الفئران بماكينة الحلاقة الحيوان وتعقيم أنه مع اليود والكحول فرك الجلد. إنشاء جيوب تحت الجلد عبر شقوق 1.5 سم في مواقع سوبراسبينال على دورسوم استخدام مشرط.
- إدراج واحد nanofiber الموسعة سقالة (1.5 مم سميكة) في جيب تحت الجلد باستخدام الملقط لكل شق. إغلاق شق استخدام دباسة.
- 1، 2، و 4 أسابيع، euthanize على الفئران مع أول أكسيد الكربون 95%2. تشريح بلطف explant والأنسجة المحيطة باستخدام مقص جراحي. قبل التحليل النسيجي، تزج الأنسجة في الفورمالين لمدة 3 أيام على الأقل، ومن ثم تضمين مع البارافين. قسم الأنسجة مع مبضع، ثم أداء ويوزين (H & E)، وتوضع ماسون لتلطيخ trichrome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الفعالية من توسيع ماتس نانوفيبير اليكتروسبون 2D التقليدية إلى السقالات 3D عبر تنفيسها السائل2 CO الحرجة قد تجلى بصفات مختلفة: زيادة سمك السقالات من 1 ملم عند دون علاج إلى 2.5 ملم و 19.2 مم مع واحد واثنين من العلاجات2 CO، على التوالي (الشكل 3 ألف-ج). خاصية المسامية بنية حاسمة بالنسبة للخلية البذر-زادت أيضا بطريقة المقابلة لزيادة سمك (الشكل 3). مسامية السقالات زاد من نسبة 79.5 في المائة الحصير غير المعالجة إلى 92.1 و 99.0% بعد العلاج الأولى والثانية، على التوالي (الشكل 3D). هذا أمر مهم لأن درجة اختراق الخلية سقالة وفعاليته للحث على التجديد ومن ثم تعتمد إلى حد كبير على مسامية1.
وكشفت الصور وزارة شؤون المرأة أن بنية سكانية معبأة، فيبريلار الحصير غير المعالجة في 2D تحولت إلى هياكل الطبقات، وأمرت بمحاذاة النانو بعد التوسع مع أول أكسيد الكربون2 (الرقم 3E-ح). خلصت دراسات سابقة إلى أن هياكل الطبقات وبالمثل مع ألياف المنظمة يمكن أن تكون حاسمة في الحفاظ على الرموز نانوتوبوجرافيك التجديد للأنسجة مثل الأربطة والعضلات والأعصاب7،8. بيد أن هذه الدراسات دراسة السقالات موسعة مع نأبه47،8. يتطلب هذا الأسلوب إضافية معالجة الوقت والمواد المذيبة التي قد ليتش الجزيئات النشطة بيولوجيا من السقالة7،8. نأبه4، عامل تخفيض قوي، ويمكن أن تتفاعل مع الجزيئات النشطة بيولوجيا مغلفة. على العكس من ذلك، تبين استخدام السائل CO2 دون المستوى الحرج للتوسع للحفاظ على بيواكتيفيتي جزيئات إضافية قبل المصنف في السقالة بالمقارنة مع السقالات توسيع استخدام الأسلوب4 نأبه (الشكل 4). وقد تجلى ذلك باستخدام صبغة الكومارين 6؛ اللون الأخضر للصبغ أبقى أفضل في السقالات موسعة مع أول أكسيد الكربون2 (الشكل 4)، مما يشير إلى أن استخدام السائل2 CO دون المستوى الحرج لنتائج التوسع في الاحتفاظ بأفضل من سلامة الجزيئات مغلفة في السقالات PCL.
حركية الإفراج من مضادات الميكروبات الببتيد ليرة لبنانية-37 من السقالات قبل وبعد التوسع تم قياسها في فيتروفيا طقم أليسا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (الشكل 5A). تقييم فعالية مضادات الميكروبات من السقالات محملة الببتيد نانوفيبير ليرة لبنانية-37 قبل وبعد التوسع مع CO2 عبر الاحتضان مع الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة). عدد المستعمرات المعيشة كان كمياً حضانة وظيفة مع السقالات. وأظهرت النتائج أن نشاط مضادات الميكروبات CO2-السقالات الموسعة، ليرة لبنانية--37-تحميل كان مماثلة إلى أن من unexpanded ليرة لبنانية-37-تحميل السقالات، مشيراً إلى أن عملية التوسع يمكن الحفاظ على بيواكتيفيتي لتغليف ليرة لبنانية-37 الببتيدات (الشكل 5 (ب)).
أجريت دراسات إضافية في فيفو بغرس تحت الجلد من أول أكسيد الكربون2-توسيع السقالات nanofiber مع ثقوب صفت ساحة للفئران. وهذا يسمح للهجرة الخلوية والانتشار داخل الثقوب وكذلك المزيد من التسلل داخل طبقات نانوفيبير التي تم إنشاؤها أثناء التوسع (الشكل 6). سقالة الموسعة أظهرت زيادة كبيرة في عدد الخلايا العملاقة مولتينوكليتيد (الشكل 6، و) من الأسبوع 1 إلى 4 وظيفة غرس وتشكيل الأوعية الدموية (الشكل 6، هاء). إيمونوهيستولوجيكال مزيد تلطيخ النتائج أشارت إلى انخفاض عدد من مستقبلات تشيموكيني ج ج اكتب 7 (CCR7)-إيجابية تسلل الضامة، وزيادة عدد الكتلة 206 التمايز (CD206)--تسلل إيجابية الضامة من الأسبوع 1 إلى الأسبوع 4 بعد زرع.
رقم 1: إعداد نموذجي اليكتروسبينينج. يتم عرض جهاز نموذجي اليكتروسبينينج متحد محور. اليكتروسبينينج يتطلب ثلاثة عناصر رئيسية: إمدادات طاقة ذات الجهد العالي، ومغزال، وجامع موصلة كهربائياً. يستخدم الغزل محوري السوائل اثنين تدور سقالة نانوفيبير؛ وهذا يسمح لتغليف الجزيئات الأخرى. ويمكن زيادة Nanofiber المحاذاة والجمعيات من خلال جامع قبل متفاوتة بسرعة دوران الاسطوانة الدورية. في هذا البروتوكول، أنشئ فوهة مخصصة باستخدام إبر حقن اثنين. فوهات مماثلة متاحة تجارياً. وهذا الرقم قد تم تكييفه من شيه، وآخرون14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الخطوات من السقالة التوسع في استخدام السوائل2 CO الحرجة- (أ) استخدام حاوية التي يمكن إغلاقها بشرط ويمكن أن تحمل الضغط، مثل أنبوب بلاستيكي للطرد مركزي 30 مل. (ب) إضافة قطعة 1 سم × 1 سم في 2D حصيرة nanofiber PCL. (ج) إضافة ~ 1 g ثلج الجاف. (د) ختم الحاوية. (ه) السماح للضغط من أجل بناء الأنبوب. وهذا بدوره الصلبة CO2 في أول أكسيد الكربون السائل2. عندما جمعت السائل، بسرعة الإفراج عن ختم الأنبوب. هذا سوف يسبب أول أكسيد الكربون السائل2 لتصبح بسرعة الغازية CO2، أسفر عن CO2 تتخلل حصيرة 2D nanofiber. (و) مراعاة سقالة 3D. قد كرر هذه الخطوات حتى يتم تحقيق السمك المطلوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تصور 2D الحصير قبل وبعد التوسع مع أول أكسيد الكربون السائل دون الحرجة2 - (أ) تظهر الصورة PCL nanofiber الحصير قبل العلاج دون الحرجة السائل2 CO (يمين) وبعد العلاج الأولى (إلى اليسار). (ب) تظهر الصورة PCL nanofiber مات قبل المعالجة الأولى مع أول أكسيد الكربون السائل دون الحرجة2 (يمين) وبعد العلاج الثاني (إلى اليسار). (ج) يظهر الرسم البياني سمك حصائر الألياف PCL قبل وبعد علاج واحد واثنين بسائل2 CO دون الحرجة. (د) يظهر الرسم البياني المسامية النسبي من حصائر الألياف PCL قبل وبعد علاج واحد واثنين بسائل2 CO دون الحرجة. (ه-ه) تظهر الصورة مظهر مستعرضة من الحصير PCL التقاطها عن طريق الصورة SEM sem. (ه-و) من PCL حصائر الألياف قبل العلاج. (ز-ح) ووزارة شؤون المرأة صورة حصائر الألياف PCL بعد العلاجات اثنين مع السائل2 CO دون الحرجة. وهذا الرقم قد تم تكييفه من جيانغ، وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: nanofiber PCL تحميل صبغة الكومارين 6 الحصير قبل وبعد التوسع مع السائل2 CO الحرجة ونابه4 المحلول. (أ) تبين الصور صارخ كمية صبغ Coumarine 6 المتبقية في السقالات PCL بعد التوسع مع أول أكسيد الكربون2 (يمين) ونابه4 (يسار). (ب) صور تظهر وجهات النظر أعلى إجمالي PCL السقالات وهذه الأسفار المقابلة بالترتيب التالي: سقالة الخام (أسفل اليمين)، حصيرة 2D محملة مع صبغ 6 كومارن (أعلى اليمين)، سقالة PCL تحميل صبغ Coumarine 6 موسعة مع أول أكسيد الكربون2 ( أعلى اليسار)، نأبه4 (أسفل اليسار). (ج) يظهر الرسم البياني كثافة الأسفار صبغة الكومارين 6 بعد ماتس PCL كانت غير المعالجة، وسعت عبر السائل2 CO الحرجة، وتوسعت عبر نأبه4 علاجات. وكان كمياً الأسفار بالبرنامج "ي الصورة". وهذا الرقم قد تم تكييفه من جيانغ، وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الجزيئات النشطة بيولوجيا مغلفة في السقالات PCL. (أ) رسم بياني يصور الإفراج النسبي للميكروبات الببتيد ليرة لبنانية-37 في 2D الأغشية والسائل2 CO الحرجة وسعت السقالات 3D (ب) الرسوم البيانية تصور فعالية مضادات الميكروبات ماتس nanofiber PCL مختلفة عندما تتعرض إلى ف . الزّنجاريّة. وهذا الرقم قد تم تكييفه من جيانغ، وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: في فيفو الردود من PCL nanofiber السقالات ودون التوسع عن طريق الحرجة CO2 في مواقع دورسوم تحت الجلد في الفئران. (أ) وصمة عار ح & ه. النقاط الخضراء تعيين حدود تسلل خلية. (ب) trichrome وصمة عار Masson's. الأسهم الخضراء تسمى ترسيب الكولاجين. (ج) الغاية تضخيم صورة وصمة عار ح & ه. الأسهم الخضراء تسمى الأوعية الدموية. (د) عالية تضخيم الصور من وصمة عار ح & ه. الأسهم الخضراء تسمى الخلايا العملاقة. (ه) يصف الرسم البياني نمو الأوعية الدموية كل مم2. (و) يوضحها الرسم البياني عدد الخلايا العملاقة أن التسلل إلى الحصير PCL 2D التقليدية مقارنة مع ماتس PCL الموسع بدون الحرجة CO2. وهذا الرقم قد تم تكييفه من جيانغ، وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحويل ماتس نانوفيبير اليكتروسبون 2D التقليدية إلى السقالات 3D الموسعة تم التحقيق فيها عن طريق شركة تنفيسها2 . ماتس نانوفيبير 2D التقليدية هي الموسعة بنجاح عن طريق السوائل2 CO دون الحرجة. الخطوات الحاسمة هي اختﻻق ماتس نانوفيبير 2D تحت شرط أمثل وقطع الحصير دون تشويه الحواف (على سبيل المثال-، باستخدام حادة مقص جراحي). هذا CO2-السقالات nanofiber موسع لها فوائد عديدة على حصائر 2D التقليدية بما في ذلك هياكل الطبقات (الشكل 3 ألف-ب)، أقل التعبئة الكثافة (الشكل 3D-H) وأعلى مسامية (الشكل 3D). هذا الأسلوب توسيع هو أيضا مفيدة بالنسبة للأساليب القائمة للتوسع في هذا أسرع لعملية ويقلل من الخسارة الكلية للجزيئات البيولوجية النشطة مغلفة نظراً لاستبعاد هذا الأسلوب من المحاليل و التجميد إجراءات8،9. ومع ذلك، الحد من هذا الأسلوب أن مورفولوجية النانو البوليمرية ينبغي لا مشوه/المذابة في السائل2 CO دون الحرجة. على سبيل المثال، لا يمكن توسيع ماتس nanofiber بلجا (50/50) باستخدام هذا الأسلوب. ويمكن توسيع هذه الحصير nanofiber استخدام سوائل الغاز أخرى.
أظهرت دراساتنا السابقة أن خلايا المصنف بطريقة أكثر اتساقا داخل السقالات nanofiber الموسعة إذا ما قورنت مع 2D الحصير8. في هذا العمل، حدث بمعدل زيادة كبيرة لتشكيل الأوعية الدموية (الشكل 6، هاء)، ولوحظت تتسرب الخلايا المناعية المضيف داخل CO2-وسعت السقالات nanofiber مع ثقوب مربعة صفت بعد زرع تحت الجلد في الفئران (الشكل 6وو). الأوعية وتسلل الخلايا المناعية تشير إلى أن السقالة الانخراط مع أنسجة المضيف وربما صاروخ موجه الخلايا اللازمة لتجديد الأنسجة التالفة؛ وهذا يعني معدل أعلى لغرس ما بعد النجاح في استضافة9.
CO2-السقالات الموسعة أيضا لديها القدرة على أن تدمج مع مجموعة متنوعة من الببتيدات والجزيئات الأخرى التي يمكن أن تساعد في الحصول على الاستجابة المطلوبة. وهنا التأثير المطلوب أن تكون سقالة لتجديد الأنسجة بينما في نفس الوقت توفير نشاط مضادات الميكروبات من خلال إدراج الببتيد ليرة لبنانية-37. كما أظهر السقالات موسعة مع السائل2 CO الحرجة استبقاء أفضل من جزيئات مدمجة بالمقارنة مع السقالات موسعة مع نأبه4. صبغ الجزيئات مغلفة داخل السقالات PCL كانت أفضل الاحتفاظ بها (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، وسعت نسبة أكبر قليلاً من الببتيد الميكروبات صدر ليرة لبنانية-37 مغلفة من شركة 3D2 السقالات عند مقارنتها بالحصير 2D (الشكل 5A). واحتفظ بيواكتيفيتي ليرة لبنانية-37 السقالات2 توسع شركة أظهرت فعالية مضادات الميكروبات مماثلة بالمقارنة مع السقالات 2D (الشكل 5 (ب)).
هذا الأسلوب الجديد لتوسيع ثلاثي الأبعاد تدل على إنتاج سقالة اصطناعية لم يعد يقتصر على استخدام الحصير 2D nanofiber. البيانات المقدمة تشير إلى أن هذا الأسلوب توسيع أفضل الحفاظ على المبلغ وبيواكتيفيتي من المواد النشطة بيولوجيا المغلفة داخل السقالات nanofiber الموسعة. في نفس الوقت، تحاكي السقالات nanofiber الموسعة في بيئات نانوتوبوجرافيك من تلك التي عثر عليها في فيفو9، سمة التي تساعد إلى حد كبير في حفز التجدد الأنسجة1. وفي المستقبل، هذه أول أكسيد الكربون2-السقالات الموسعة قد تكون التطبيقات المحتملة في مساعدة الجرح الشفاء والأنسجة والتجدد، وكذلك كما هو الحال في إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد من الأنسجة وتسليم العقاقير الخاضعة للمراقبة محلياً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أنه لا يوجد أي تعارض في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بالمنح من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (نيجمس) في المعاهد الوطنية للصحة (2 ف 20 GM103480/06 و 1R01GM123081 إلى J.X.)، الأموال أوتيس غليب مؤسسة البحوث الطبية، LB606 ني، وبدء التشغيل من جامعة نبراسكا الطبي مركز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-199-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Rotating Steel Drum | customized | This serves as a collector during electrospinning. | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Coaxial spinning requires two single syringe pumps. |
| Revolver | Lab Net International | H5600 | Adjustable lab rotator for mixing solutions |
| Hypodermic Needle (27G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26426 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| Hypodermic Needle (21G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26416 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | |
| LL 37 ELISA Kit | Hycult Biotech | HK321-02 |
References
- Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
- Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626 (2015).
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
- Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
- Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
- Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
- Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
- Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
- Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
- Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
- Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
- Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).
