Summary
ここでは、C57BLにおけるブレオマイシンの気管内注射による肺損傷の誘導後に臍帯全体から得られた静脈内注入ヒト間葉間質間質細胞の抗線維活性を調べるための有効な方法を提示する。/6マウス。このプロトコルは、他の治療薬の前臨床試験に容易に拡張することができる。
Abstract
肺線維症は、異なる病因を持ついくつかのヒト肺疾患の特徴である。現在の治療法はかなり限られているので、マウスモデルは新しい抗線維性戦略を開発するために不可欠なツールであり続けています。ここでは、ブレオマイシン誘発性肺損傷の減衰において臍帯全体(hUC-MSC)から得られたヒト間葉間質間質細胞の生体内抗線維化活性を調べるための有効な方法を提供する。C57BL/6マウスは、ブレオマイシン(1.5U/kg体重)の単一の気管注射を受け、続いて、末静脈にhUC-MSC(2.5 x10 5)を二重注入し、ブレオマイシン投与後24時間および7日後に投与した。8日目、14日目、または21日目に犠牲を起こすと、炎症性および線維性変化、コラーゲン含有量、および移植された肺組織におけるhUC-MSCの存在が分析される。マウス気管へのブレオマイシンの注入は、肺の直接的な標的化を可能にし、広範な肺炎症および線維症を引き起こす。hUC-MSCの二重用量の全身投与は、ブレオマイシン誘発性肺損傷の早期鈍化をもたらす。静脈内注入されたhUC-MSCは、マウス肺に一時的に生着し、そこで抗炎症および抗線維芽生活性を発揮する。結論として、このプロトコルは、ヒト肺線維症の実験マウスモデルにおけるhUC-MSCの前臨床試験に正常に適用された。しかし、この技術は、肺の病態生理学に対する異なる気管内投与物質の効果を研究し、新しい抗炎症および抗線維性全身療法を検証するために、両方とも容易に拡張することができる。
Introduction
肺線維症は、細胞外マトリックス成分の過剰な沈着を特徴とする進行性病理学的プロセスであり、主にI型コラーゲン、肺間質において、肺機能障害を引き起こしうる。これは、異なる病因を持ついくつかのヒト肺疾患の特徴であり、貧弱な臨床予後因子を表す。現在の治療法はかなり限られているので、マウスモデルは、疾患の発症と進行に影響を与える病原性メカニズムのさらなる調査と新しい抗線維性の開発の両方に不可欠なツールであり続ける戦略2,3.
今日まで、ブレオマイシンの投与は、実験的に誘発された肺線維症4の最も一般的に適用されたモデルであった。複数の送達方法(静脈内、皮内、皮下、および吸入を含む)のほかに、ブレオマイシンの気管内注射または気管内注射は、最も頻繁に使用される経路4、5として出現している。我々がここで説明する方法は、気管粘膜に対するブレオマイシンのスケーリング効果を回避するために開発された。実際には、気管を外装し、作動顕微鏡を介して可視化することにより、上気道にこぼれることなく、ブレオマイシン溶液の全容積を直接下部気道に注入することが可能です。必要な外科的専門知識および器械使用が利用できる場合、この方法は以下に報告される肺の炎症および線維症の安全で、強く、再生可能な誘導を可能にする。
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Protocol
すべての動物のケアと実験手順は、イタリア保健省(認可n.456/2016-PR)によって承認され、ヘルシンキ条約の宣言に従って行われました。
1. マウス
- それらを購入した後、マウスが注射の少なくとも7日間順応することを許可する。
注:マウスは、病原体のない条件下で動物施設に収容され、12時間の光/暗いサイクルで一定の温度と湿度の下で維持され、水および標準的なペレット食品への自由なアクセスを与えられた。 - メスのC57BL/6マウスを使用し、生後12~16週目に注射する。
2. ブレオマイシンの気管内注射
- ブレオマイシン製剤
注意:化学物質の分類と標識(GHS)の世界的に調和したシステムに基づいて、ブレオマイシンはGHS08健康被害に分類されます。- 化学フードの下にブレオマイシンを準備します。
- 所望の作業濃度(0.05 U/100 μL)を得るために、無菌生理生殖塩分の30mLで凍結乾燥ブレオマイシン硫酸の15Uを再懸濁する。
- 血栓の形成を避けるためにチューブを反転してサンプルを慎重に混合します。
- チューブに再サスペンションの日付を適切にラベル付けし、4°Cに保管し、24時間以内にその内容を使用してください。
- インスティテーションの前に、ブレオマイシン溶液を室温に平衡化する。
注:この実験では、ブレオマイシンの1.5U/kg体重の単回用量を使用して、C57BL/6マウスの肺損傷を誘導した。それにもかかわらず、各マウス株は、ブレオマイシン6、7に対して異なる感度を有する。ブレオマイシンの滴定は、実験に使用されるマウス株における最適な用量を決定するために行われるべきである。
- 麻酔
- 無菌生理食生の9mLと絶対エタノールの1mL(20mg/mLの作業濃度で)に2,2,2-トリブロモエタノールの0.2gを溶解することにより麻酔を調製する。
- 血栓の形成を避けるためにチューブを反転することによって完全に混合します。
- 適切に準備の日付とチューブをラベル付けし、暗闇の中で4 °Cでそれを保存し、3日以内にそれを使用します。
- マウス1匹につき250μLのトリブロモエタノール溶液(体重200mg/kgの最終用量)の経皮注射でマウスを麻酔し、1mL注射器と26G針を用いた。
注:この用量では、マウスは少なくとも20分間意識不明である。必要に応じて、マウス応答に応じて投与量を調整し、獣医師と相談する。 - マウスの呼吸を監視します。呼吸速度はわずかに低下します。数分後、マウスの足の1つをつまんでペダル反射の欠如を確認します。
- 気管内注射
- すべての手順の間に無菌状態を維持します。滅菌手術器具および材料を使用し、滅菌手袋を着用し、非滅菌表面との接触を避ける。
- 麻酔されたマウスを手術用プラットフォームの背中に置き、手術用テープストリップで脚を繊細に固定して所定の位置に保持します。
注:マウスの脚の穏やかなテーピングは、マウスが回転中に外科プラットフォームから離れて滑るのを避けることをお勧めします(ステップ2.3.10)。 - 熱したマットの上にマウスを置き、直腸温度を介入を通じて37°Cで安定した状態に保ちます。直腸プローブで直腸温度を測定します。
- 子宮頸部の下に、例えば歯科綿ロールを「枕」を置くことによって、マウスの首をゆっくりと伸ばす。
- かみそり刃で喉をそっと剃ります。
- アルコールで外科領域から毛髪を取り除き、1%のポビドネヨウ素溶液でマウスの皮膚を数回消毒する。
- 解剖学的鉗子のペアで皮膚をつまみ、リングハンドル、湾曲した鈍いはさみを使用して、マウスのステルノヒオイド筋肉の対応で短い切開を行います。
注:皮膚の切開は、長さ約0.5センチメートルです。取り除かれた対応する皮膚片は非常に小さいので、マウスの首に張力を生じさせます。 - 綿毛棒で出血を止めてください。
- 鈍い解剖によって気管を外装し、脂肪および他のティッシュから穏やかにそれをきれいにする。
- 外科用プラットフォームを回転させて、マウスの頭をオペレータに向けます。
注:この位置は、オペレータが注射中に、それが肺にまっすぐに気管の自然なパスに従うように注射器を角度付けすることを可能にします。 - 操作顕微鏡の下にマウスを置き、気管の視覚化に役立ちます。イルミネーションを調整し、倍率(1~1.2)、フォーカス、シャープネスを設定します。気管は白い半透明の管として容易に区別することができ、気管リングは明確に見える。
- ブレオマイシン溶液を穏やかにピペッティングして混合し、100 μLを25Gの針で0.5mLの注射器に吸引し、気泡形成を避ける。
- 気管をはっきりと可視化したら、30°の角度で針先で慎重に穿刺する(図1A)。
- 100 μLのブレオマイシンまたは無菌生理生理(車両制御)を気管の内腔に直接注入します。ボリューム全体が針を下ろすまで数秒待ってから、気管から取り外します。
- 針が気管に正しく挿入されたときに発生する無呼吸の数秒を観察し、マウスがすぐに液体の体積全体を吸い込むようにします。
- マウスが液体を吸い込んでいない場合は、呼吸を注意深く監視し、針の位置を調整します。マウスが呼吸を停止した場合は、すぐに針を取り外し、マウスが正常に呼吸を再開してから再挿入できるようにします。
- 注射後に注射器と針を安全に捨てなさい。
- 皮下筋膜と皮膚創傷を5-0吸収性縫合糸で閉じる。
注:完全に再吸収されない場合は、手術後7〜10日後に縫合糸を取り除きます。
- 動物の回復
- 注入したマウスを回復用の加熱パッドの横に置きます。
- マウスの呼吸を監視し、マウスが動き始め、厳しい回復と完全な意識を取り戻すまで観察します。
- マウスの状態が良好であることを確認したら、元のケージに戻します。完全に回復するまで、他の動物の会社に返却しないでください。
- 長期の鎮痛を確保し、残存後の介入後の痛みを避けるために、皮下ブプレノルフィン(体重0.05mg/kgの最終用量で)を12時間の後気管注射ごとにマウスに投与する。
- ブレオマイシンの気管注射後24時間マウスを調べ、1日2回行う。呼吸困難、体重減少、行動異常、および罹患率の兆候がないか、マウスを監視します。
3. ヒト臍帯間間質間質細胞の尾静脈注入
- 細胞製剤
注:ヒト臍帯からの間葉間間間質間質細胞の単離、特徴付け、および培養は、以前に8、9、10について説明した。hUC-MSCは無菌的に操作され、注入されるべきである。したがって、無菌フードの下ですべてのステップを実行します。- hUC-MSCを75cm2培養フラスコで早期通路(最大1~3個)に拡大します。
注:hUC-MSCは、マウスへの注入の日に70%のコンフルエントでなければなりません。 - 無菌リン酸緩衝生理食べ物(PBS)の10mLで細胞を室温で洗浄します。
- トリプシンの2 mLを追加し、それらが切り離し始めるまで、約1分間37°Cで細胞をインキュベートします。
- 10%の胎児ウシ血清(FBS)を含むhUC-MSC完全培地の8 mLを添加してトリプシンを中和する。
- 350 x gで10分間遠心分離によって細胞を集める。
- 滅菌生理生理生でペレットを再懸濁し、Bürker室を使用して細胞を数えます。マウス当たりの無菌生理生殖水の200 μLで細胞を2.5 x 105の最終濃度に希釈することにより、注入用の細胞懸濁液を調味する。すべてのマウスを注入するのに十分な体積があることを確認するために、余分な細胞懸濁液を準備します。
- 注入の前に氷の上に細胞を保つ。セクション 3.3 で説明するように、数時間以内に注入します。
- hUC-MSCを75cm2培養フラスコで早期通路(最大1~3個)に拡大します。
- 麻酔
注:注射中にマウス尾静脈を損傷するリスクを最小限に抑えるために、マウスを動かしてはいけません。したがって、麻酔は、単純なマウス拘束よりも好ましい。- 誘導室で4%イソファラン吸入によりマウスを麻酔する。
- マウスの呼吸を監視します。呼吸速度はわずかに低下します。数分後、マウスの足の1つをつまんで、適切な麻酔を確認します。
- 尾静脈注入
- 意識不明が確認されたら、無菌hUC-MSC静脈内注入用の無菌フードの下にマウスを置きます。
- 1.5%のイソファランの連続的な流れを持つ顔のマスクを介して実験全体を通して全身麻酔を維持する。
- 血管拡張を促進し、より容易な注射を可能にするために、2分間温水にマウスの尾を浸します。
- 細胞が塊を形成しないことを確認するために穏やかにピペッティングによって細胞懸濁液を混合します。26 G の針を使用して 1 mL シリンジに 200 μL を吸引し、気泡の形成を回避します。
- マウスの尾を先端で持ち、そっとまっすぐにします。
- マウステールの横静脈を見つけます。メスでそっとこすり、70%エタノールで拭きます。
注:尾の緩やかな削り取りは、髪を除去するために行われ、注射部位がより滑らかでクリーンになります。 - 尾部の遠位部分から始めて、針を15°の角度で静脈に挿入し、hUC-MSCまたは無菌生理食生の200 μLをゆっくりと注入する(図1B)。
- 抵抗なしで静脈に入る液体による静脈内注入の成功を監視し、贅沢の欠如によって。ボリューム全体が針を下ろすまで数秒待ってから、静脈から取り外します。
- 出血を防ぐために、無菌ガーゼで創傷口に圧力をかける。
- 注入後に注射器と針を安全に廃棄します。
- 動物の回復
- 注入したマウスをヒーターパッドの横に置き、回復します。
- マウスの呼吸を監視し、マウスが動き始め、厳しい回復と完全な意識を取り戻すまで観察します。
- マウスの状態が良好であることを確認したら、元のケージに戻します。完全に回復するまで、他の動物の会社に返却しないでください。
- 尾静脈注入後24時間、1日おきにマウスを調べ、健康状態を監視し、苦しみや病理学的徴候を早期に検出する。
4. 臓器移植および組織処理
- 注射麻酔薬の過剰摂取によりブレオマイシン投与後の8日目、14日目、または21日目にマウスを犠牲にする(図1C)。
- 気管と肺を切除し、すぐに氷冷PBSでそれらを洗浄します。
- 液体窒素中の右肺をスナップフリーズし、その後の分子分析10のために-80 °Cでそれらを保存します。
- 4%のパラホルムアルデヒドで左肺を膨張させ、24時間10%の中性緩衝ホルマリン溶液で固定します。その後、グレードのアルコールシリーズでそれらを脱水し、キシレンでそれらをクリアし、パラフィン10にそれらを埋め込みます。
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Representative Results
肺損傷は、無菌生理生殖量の100μLでブレオマイシン硫酸の1.5 U/kg体重の単一の気管注射によって誘発された。対照動物は、等量の生理生理生理の気管内注射を受けた。hUC-MSC(無菌生理食生の200μLで2.5 x 105)の2ショットを、ブレオマイシン投与後24時間および7日後にマウス尾静脈に注入した。対照動物は、無菌生理生理の等量の静脈内注入を受けた。マウスは、ブレオマイシン投与後8日目、14日目、および21日目に肺の切除および組織処理のために屠殺した(図1)。
我々は、マウス気管へのブレオマイシンの直接注入が肺への急速な拡散を可能にし、広範な炎症、進行性線維症、および彼らの正常なアーキテクチャの歪みを引き起こしたことを、以前の研究と一貫して実証した。11.肺の病理学的変化はヘマトキシリン-エオシン(H&E)およびピクロシリウス赤色染色10によって評価され、線維症はヒドロキシプロリン含有量およびコラーゲン沈着の増加によって確認された(図2)。組織の炎症性変化は、気管支、気管支、および血管の周りの炎症浸潤に基づく組織学的スコアリングシステムによって評価され、ヘマトキシリン-エオシン染色肺セクション10で観察された間質性肺炎。ブレオマイシン注射に続いて、肺切片のアシュクロフトスコアは、8日目の平均値1.5から14日目の平均値4.5、21日目10日目の6.5に徐々に増加した。マウス尾静脈へのhUC-MSCの二重注入は、ブレオマイシン誘発性肺損傷を大きく減衰させ、完全な剥奪ではないが、炎症浸潤および各時点における線維化の程度の両方((図2)特異的抗体10を用いた免疫染色は、hUC-MSCを急速かつ効果的に注入し、マウス肺に到達したことを示したが、検出された細胞はごくわずかであり、8日目から21日目まで減少した(図3)。以前に報告された12として、これらのデータは、その長期の保護効果にもかかわらず、傷害部位からの細胞の急速な転位を示唆している。hUC-MSCの免疫組織化学(IHC)染色は、生理生理生殖量検体においても行われたが、hUC-MSCを引き付ける炎症性病巣がないことを考えると、細胞は検出できなかった。
図1:実験プロトコルの概略図。(A) マウスは、肺損傷を誘発するためにブレオマイシンの1.5 U/kg体重の単一の気管(e.t.)注射を受けた(0日目)。(B)全臍帯(hUC-MSC)から得られた2.5 x 105ヒト間葉間質間質細胞の二重静脈内(i.v.)注入を、ブレオマイシン投与後24時間(1日目)及び7日目(7日目)に行った。(C) 注射と犠牲の瞬間のタイムラインをここに示します。マウス群は、ブレオマイシン投与後8日目、14日目、及び21日目(すなわち、24時間、7日目、および第2hUC-MSC注入後14日目)で犠牲とした。この図は、Moronciniらから変更されています.10.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:hUC-MSCは、ブレオマイシン誘発肺炎症および線維症を下調節する。(AとB)C57BL/6マウスから得られた肺切片の代表的な顕微鏡画像(10倍倍)とピロシリウス赤色染色、無菌生理生理(生理)またはブレオマイシン(ブレオマイシン)の内気管注射後21日目、後者はまた、hUC-MSC(ブレオマイシン+hUC-MSC)または滅菌生理生理(ブレオマイシン+生理生殖器)の静脈内注入が続く。生理生理生理知の制御は正常な肺の建築を示した。広範囲にわたる炎症浸潤は、ブレオマイシン損傷の21日後に観察され、肺建築の重度の歪みおよび線維性病巣の形成を伴った。ブレオマイシン誘発性変化は、hUC-MSC治療によって有意に減衰したが、生理生理によっては減衰しなかった。(C)前述の治療を受けたC57BL/6マウスの肺における8日目、14日目、および21日目のヒドロキシプロリン含有量。結果は、平均±SD(n=8群当たり)であり、気管生理食動物処理マウスから得られた値のパーセンテージとして表され、3つの独立した実験を代表する。*P < 0.05, **P < 0.01, ブレオマイシン処理マウスと比較.(D) マウスCol1A1発現レベルは、前述の治療を受けたC57BL/6マウスから8日目、14日目、および21日目に得られた全肺mRNAにおける発現レベルである。結果は平均±SD(1群あたりn=5)であり、三量体で行われた3つの独立した実験を代表する。*P < 0.05, **P < 0.01, ブレオマイシン処理マウスと比較.この図は、Moronciniらから変更されています。10.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:肺組織におけるhUC-MSCの検出(AおよびB)C57BL/6マウスから得られた肺切片の抗HLA-1抗体を用いた免疫染色の代表的な顕微鏡画像(それぞれ200xおよび400倍倍)に続いて静脈内出血性を受けた。 hUC-MSC.赤い矢印は正染色されたhUC-MSCを示す。(C) ヒトGAPDHは、注入前に培養されたhUC-MSCから抽出された全mRNA全体の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイ(注入されたhUC-MSC)または肺組織から8日目、14日目、および21日目に内気管内を受け取るC57BL/6マウスのアッセイによって評価されるブレオマイシンに続いて静脈内hUC-MSC(ブレオマイシン+hUC-MSC)が続く。結果は平均±SD(1群あたりn=5)であり、三量体で行われた3つの独立した実験を代表する。なお、この実験プロトコルにおけるヒトGAPDH転写物の供給源は、静脈内注入されたhUC-MSCによってのみ提供することができる。この図は、Moronciniらから変更されています。10.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
気管内投与は、外因性薬剤を肺に送り込む優遇経路である。数年以来、気管へのブレオマイシンの直接注入は、肺線維症13を誘導するために広く使用され、最近では、より高度な、非侵襲的な技術は、この14、15を達成するために開発されています 、16.
ここで説明する方法は、いくつかの潜在的な制限に対していくつかの意味のある利点を提供します。気管の注射は外科的介入を必要とし、深い動物の介助の必要性と共に、処置自体によって引き起こされる合併症の可能性を運ぶ。したがって、手順を完成させるには、良好な準備と練習が必要です。また、マウスの苦しみを最小限に抑えるためには、マウス株と個々の応答に応じて麻酔薬の適切な用量を設定し、動物の沈降状態の厳密な観察を維持することが不可欠です。それにもかかわらず、我々は非常に低い死亡率と麻酔からの最適な動物の回復を観察した。ケタミンおよびキシラジンは、麻酔、ならびにトリブロモエタノールに使用することができる。しかし、マウスでは、ケタミンとキシラジンの有効用量は致死量に近い;したがって、彼らは容易に呼吸停止を誘発することができます。逆に、トリブロモエタノール剤の使用は容易に調整することができ、したがって、好ましい麻酔剤である。気管へのブレオマイシンの気管内注射に続いて、我々はいかなる副作用も観察しなかった。マウスは発熱がなく、気管と皮膚創傷の周りに炎症や感染の兆候は認められなかった。そのため、抗生物質の予防は必要なかった。さらに、作動顕微鏡の使用はオペレータが注入の前にマウス気管への針の正しい配置を正確に監視することを可能にすることによって成功の高い信頼を保障し、従ってそれを傷つける危険を最小にする。
ブレオマイシンの気管内注射は、両方の肺で強力な炎症性および線維性応答をもたらすと人間の間質性肺疾患(ILD)の実験的マウスモデルを生成する堅牢な方法として見ることができます。しかしながら、前に文書化された7として、マウスにおけるブレオマイシンに対する線維性応答は、ひずみ依存性および性別および年齢関連である。したがって、プロトコルの成功は、すべての実験設定でブレオマイシンの許容用量を見つけることが重要です。この研究の主な関心は、若年成人女性に大きく蔓延する全身性硬化症に関連する間質性肺疾患であったため、この研究で女性マウスを用いた。3〜4ヶ月齢のマウスは、成人期に入る年齢(マウスは8〜12週齢で性的成熟を達成する)17歳であるために選択された。したがって、それらは若い成人マウスであると考えられ、肺線維症は非常に若い個体では一般的ではないため、若い動物よりも好ましい。彼らはまた、以前の研究18は、高齢マウスが肺線維芽細胞表現型に変化を示したことを実証しているので、古い動物よりも好ましく、肺損傷後の修復および線維症に対する感受性の増加につながる。ここに示す実験モデルで可能なバイアスを表す可能性があります。
尾静脈注入は血流への薬物の急速かつ有効な配達を保障する簡単で、信頼できる、そして非侵襲的な方法である。それは簡単な医療機器、短い手動訓練および減らされた費用と容易に行うことができる。
ここで説明する実験プロトコルは、以前に発表された研究19、20、21から改変され、マウスへの細胞生着を増強するために2.5 x 105 hUC-MSCの二重静脈注入が存在する肺とその治療効果。実際には、手順は非外傷性であるので、同じ動物で繰り返すことができるが、2つの連続した注射の間に7日間の期間が推奨され、最終的な家臣創の修復を可能にする。また、手術中にC57BL/6マウスを麻酔するためにイソファラン吸入を行い、突然の動物の動きに対する尾静脈損傷を回避しました。
結論として、このプロトコルは、C57BL/6マウスにおける肺線維症を効率的に誘導し、hUC-MSCの生体内抗線維化効果を検証することに成功した。この方法は、異なる実験的肺疾患モデルを生成するために、気道にブレオマイシン以外の薬剤または薬剤を投与するためにも使用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この仕事は、大臣イタリアン・デッラ・サルーテ(アルマンド・ガブリエリへの)からの助成金RF-2011-02352331によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
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