Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi
Summary
3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.
Abstract
Tümörü ifadede protein analizi onun patoloji çalışma çeşitli yönlerini ilgilidir. Çok sayıda protein tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşması devlet uygulamaları ile biyolojik olarak tarif edilmiştir. Bu biyolojik analizleri de tümörü hasta ve tümörü modelleri üretilen tümör neurospheres (NS) karakterize etmek kullanışlıdır. Tümör NS hangi onlar türetilmiştir ve daha doğru olabilir ayna gliyom biyoloji tümör farklı özelliklerini değerlendirmek için değerli vitro modeli sağlar. Burada biz biyolojik tümör NS içinde analiz etmek için ayrıntılı bir yöntem tarif parafin gömülü tümörle NS immünhistokimya (IHC) kullanarak.
Introduction
Gliomas tarafından fenotipik ve genotypic özellikleri1Dünya Sağlık Örgütü göre sınıflandırılmış merkez sinir sisteminin birincil solid tümör vardır. Bu sınıflandırma varlığı ya da yokluğu biyolojik2çekici bir kaynağı temsil sürücü mutasyonlar içermektedir. Biyolojik ölçülen ve terapötik müdahale3farmakolojik yanıtlarının yanı sıra normal ve patolojik işlemleri belirtmek için değerlendirilen biyolojik özellikleri vardır. Biyolojik tespit tümör doku ve hücreleri tümörü türetilmiş, farklı açıdan biyolojik onun karakterizasyonu etkinleştirme. Mutasyona uğramış isocitrate dehidrogenaz 1 (IDH1), bir mutant enzim daha iyi prognoz4ile ilişkili alt-sınıf gliomas karakteristik gliyom biyolojik bazı örnekler. Mutasyona uğramış IDH1 sık sık TP53 ve alfa-talasemi/mental retardasyon sendromu X’e (ATRX) ile birlikte dile getirdi-mutasyon ihracı, belirli bir gliyom tanımlama alt tür4,5. ATRX ihracı mutasyonlar da Pediatrik yüksek kalitede gliomas2,%6 44’ortaya çikmaktadir ve agresif tümörler ve genomik istikrarsızlık6,7ile ilişkili bulunmuştur. Buna ek olarak, Pediatrik diffüz içsel pontine gliomas (DIPG) bir K27M mutasyon histon H3 gen H3F3A veya HIST1H3B/C gen1,6olup göre alt gruplar farklı. Bu nedenle, alt bölümü, çalışma ve gliomas tedavisi daha daha fazla gelişimi sağlayacak ayrı varlıklar olarak Moleküler Karakterizasyonu giriş izni hedefli tedaviler her alt türü için. Buna ek olarak, biyolojik analizini apoptosis8, autophagy9, hücre döngüsü ilerleme10, hücre proliferasyonu11ve hücre farklılaşması12 gibi farklı biyolojik süreçlerin değerlendirmek için kullanılabilir .
İnsan kanser mevcut genetik lezyonlar liman genetiği hayvan modelleri hastalık ilerleme aracılık yolları sinyal çalışması için kritik önem taşımaktadır. Bizim Laboratuvar insan gliyom alt türlerinden13,14özetlemek belirli mutasyonlar yataklık gliyom genetiği fare modelleri geliştirmek için uyku Güzellik (SB) transposase sistemi hayata geçirdi. Bu genetik fare modelleri vitro çalışmalar 3D sisteminde etkinleştirmek tümör kaynaklı NS oluşturmak için kullanılır, tümör içinde in situ15‘ te yansıtma belirgin özellikleri mevcut. Ayrıca, NS orthotopical nakli fareler içine özelliklerini birincil tümör korumak ve karşılık gelen birincil tümörün15histopatolojik, genomik ve fenotipik özellikleri taklit ikincil tümörler oluşturabilirsiniz.
Kültür, serum-Alerjik Beyin tümör hücreleri kök hücre özellikleri ile zenginleştirilmiş ve epidermal büyüme faktörleri (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) huzurunda onlar NS kültürler gibi tek hücre kaynaklı koloniler olarak yetiştirilir. Kök Hücre Böl ve hücresel kümeleri oluşturur, ancak bu seçici kültür sistemi içinde en ayırt edici veya farklılaşmış hücreler hızla, ölmek. Bu tümörü tümör Özellikler16,17,18tutar bir NS kültür üretimi sağlar. Tümörü NS tümör biyolojisi, tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşma durumu da biyolojik analizi de dahil olmak üzere çeşitli yönlerini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, tümörü NS oluşturmak ve 3D kültürler parafin içinde kullanılmak üzere embed için bir protokol ayrıntılı IHC boyama için. Sabitleme ve tümörü NS gömme bir NS morfolojisi daha iyi hangi gliyom NS hücre ayrılma için stresli işleme tabi tutulur ve basık haline geleneksel cytospin yöntemi19‘ a, göre korunur üstünlüktür. Buna ek olarak, gömme genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleştirme herhangi bir endojen fluorophore ifadeden quenches. Bu yöntem genel işlem katıştırma parafin ile tümörü hücreleri 3D yapısını korumak ve karakterizasyonu tümörü neurospheres immünhistokimya kullanarak etkinleştirmek için hedeftir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, hangi içinde beyin içinde in situbüyüyen tümör hücreleri karakteristik 3D yapısını korumak immünhistokimya parafin gömülü gliyom NS, gerçekleştirmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem ayrıntı. Bu teknik cam veya plastik yüzeyler kaplama hücreleri kullanarak üzerinde aşağıdaki avantajları vardır: Ben) NS; 3D yapısını korunması II) protein ifade analiz önce hücre ayrılma stresinin önlenmesi; III) genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleşti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser ulusal kurumları, Sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar & kontur (NIH/NINDS) hibe R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 için M.G.C. tarafından desteklenen; NIH/NINDS verir R01-NS076991, R01-NS082311 ve R01-NS096756 P.R.L. için; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Nörocerrahi bölümü; Leah’ın mutlu Kalpler M.G.C. ve P.R.L.; ve RNA Biyomedikal Grant F046166 M.G.C. F.M.M. için bir F31 NIH/NINDS-F31NS103500 tarafından desteklenir. J.P. bir Fulbright-Arjantinli Bakanlığı spor ve eğitim bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Recherche en cancérologie. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
