Wet-spinning-baserede Molding proces af gelatine for vævsregeneration

Summary

Vi udviklede og beskrive en protokol baseret på begrebet våde spinning for opførelsen af gelatine-baseret Biomaterialer bruges til anvendelsen af vævsmanipulering.

Abstract

Denne artikel præsenterer en billig metode til at fremstille gelatine, som en naturlig polymer i monofilamenter fibre eller i andre passende former. Gennem den våde spinning metode, fremstilles gelatine fibre ved glat ekstrudering i en egnet koagulation medium. For at øge den funktionelle overfladen af disse gelatine fibre og deres evne til at efterligne funktionerne af væv, kan gelatine blive støbt i en tube form ved at henvise til dette begreb. Undersøgt af in vitro- og in vivo test, vise gelatine rør et stort potentiale for anvendelse i vævsmanipulering. Fungerer som en passende fylde hullet materiale, gelatine rør kan bruges til at erstatte væv i det beskadigede område (fx i nervøs eller hjerte-kar-systemet), samt at fremme regenerering af at yde en direkte udskiftning af stamceller og neurale kredsløb. Denne protokol indeholder en detaljeret procedure for at oprette en biomateriale, baseret på en naturlig polymer, og dets gennemførelse forventes at stor gavn udviklingen af korrelationsmaalinger naturlige polymerer, som bidrager til at realisere væv revitalisering strategier.

Introduction

Den seneste udvikling i væv revitalisering indebærer anvendelse af vævsmanipulering, som repræsenterer en udfordring for forbedring af nye terapeutiske strategier i medicinske behandlinger. For eksempel, udgør begrænset potentiale af nervesystemet regenerering, følgende skade eller sygdom, en væsentlig sundhedsproblem på verdensplan. På grund af kompleksiteten af patofysiologiske processer forbundet med nervesystemet, brug af traditionelle autograft eller gennemførelsen af stabilisering kirurgi har vist sig at tilbyde fordele i funktionelle resultater, men der er ingen stærke beviser for virkningerne af spinal fiksering kirurgi^1,2. Væv på det beskadigede område er mistet og erstattet med hypertrophically induceret astrocytter³, til sidst danner en tæt glial ar^4,5. Denne matrix fungerer som en barriere at blokke genopretning af nerve funktion^6,7 og er således stærkt hindrer regenerering. Derfor, en passende fylde hullet materiale forventes at forhindre tab af væv og reducere dannelsen af ar-associerede bindevæv ved at opretholde integriteten af det beskadigede område, samt ved at give direkte udskiftning af neurale celler og kredsløb at fremme axon regenerering.

Polymere biomaterialer har været foretrukne som stilladser for væv revitalisering terapi, baseret på reguleringen af celle eller axon adfærd og væv progression gennem naturlige ekstracellulære matrix (ECM) støtte. Formatet fiber er almindeligvis betragtes som en byggesten for forskellige materialer, på grund af dens endimensional struktur⁸. Fibrene kan generelt fås ved at smelte ekstrudering eller våde spinning metode; men den store størrelse og omkostningerne ved udstyr og vanskeligheder ved at udføre disse metoder er udfordrende. Derudover har flertal af for arbejdet i forbindelse med polymer fibre været fokuseret på syntetiske eller komposit materialer. Naturlige polymerer som en kilde til biomateriale tilbyde bedre biokompatibilitet egenskaber for den menneskelige krop. Ikke desto mindre, for at få tilpasningen af naturlige polymer fibre er relativt mere vanskeligt end af syntetisk polymer kilder⁹. Konvertering af en naturlig polymer som en rig kilde til protein i biomateriale fibre er derfor en vigtig strategi — ikke kun kan biomateriale fibre blive direkte isoleret fra råvarer, således at man undgår en unødig transformation til monomerer, men den protein fibre har også et godt udseende og positiv egenskaber¹⁰.

I denne forbindelse, beskriver vi en billig forarbejdningsmetode til fremstilling af naturlige polymer fibre gennem det grundlæggende koncept af våde spinning, der kan implementeres på laboratoriet skala for vævsmanipulering. Våd spinning er udført af ekstrudering og koagulation af en polymer løsning til en egnet polymer nonsolvent. En passende, tyktflydende løsning doteret til koagulation medie forårsager polymer molekyler til at opløse. Gennem overgang fase glødetrådenes derefter mister deres opløselighed og er fældet i form af en solid polymer fase¹¹. Henviser til dette begreb, udvidet vi derefter udvikling af gelatine i formen tube af en støbeprocessen, som anses for korrekt for væv revitalisering ansøgning. Derudover uløseligt, kan vi også udvikle enhver form af materialet fra gelatine fibre (fx gelatine conduit rullet op fra flere gelatine fibre), for andre ønskede applikationer.

Gelatine, biologisk nedbrydeligt naturlige polymerer, er dannet af denatureret og hydrolyseret kollagen, herunder eventuelle semicrystalline, amorf eller tredobbelt spiralformet tilstand af kollagen¹². Det er velkendt, at kollagen er den væsentlige strukturelle protein i alle bindevævet af hvirveldyr og hvirvelløse dyr^13,14, der svarer til protein struktur af de vigtigste ECM, der inducerer nerve vækst og samtidig erstatter en stor mængde af glykosaminoglykan udskilles i løbet af rygmarvsskader. Derfor ville brugen af gelatine som en kilde være et godt valg for enhver medicinsk køretøj. Udover at være en billig kilde, gelatine er også biologisk nedbrydeligt og cytocompatible og klinisk bevist at være en midlertidig fejl fyldstof¹⁵. Udviklet sig til en tube form, vise in vitro og in vivo prøver beskrevet her, at gelatine har en fremragende biokompatibilitet og egnethed for fremtidige tissue engineering applikationer. Kulturperler med menneskelige adipøst stamceller, gelatine rør forbedre Celledifferentiering af neurale stamceller ved hjælp af positive nestin farvning som neurale celle markør. Derudover forventes gelatine som fylde hullet materiale, som fremstillet ved den metode, der er etableret i denne undersøgelse, at være overskueligt og sikkert og til stor gavn væv ingeniører, der i øjeblikket udvikler korrelationsmaalinger naturlige polymerer til forbedring af væv regenerering strategier.

Protocol

De fedtvæv blev indhentet fra ortopædisk kirurgi, som attesteret af de institutionelle Review Board i Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan, R.O.C. procedurer, der involverer dyr emner er blevet godkendt af Animal Care Udvalget på nationalt Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C). 1. våd Spinning proces Løsning forberedelse Opløses 5 g gelatine pulver i 100 mL dobbeltdestilleret vand at få 5% (w/v) opløsningens koncentration. Bland…

Representative Results

I denne undersøgelse udviklet vi med succes gelatine i fibre (fig. 2A) og rør (figur 2B, C) gennem begrebet brugervenlige våde spinning. Disse gelatine-baserede materialer kan udnyttes som enhver medicinsk værktøj, afhængigt af deres figurer. I betragtning af at den funktionelle overflade og ramme af sådanne materialer er mere velegnede til vævsregeneration, undersøgte vi biokompatibilit…

Discussion

Vi præsenterede udviklingen af gelatine-baseret Biomaterialer ved hjælp af en simpel våd spinning teknik, der kan anvendes i studiet af naturlige polymerer til væv revitalisering. Dette arbejde viste muligheden for gelatine fabrikation som en stor proteinkilde uden tilsætning af andre kilder, med formålet at optimere egenskaber af gelatine, selv. Udviklingen af gelatine-baseret Biomaterialer blev udelukkende udført i stuetemperatur (22-26 ° C). En blid løsning forberedelse er et kritisk skridt i protokollen, som…

Materials

Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	–
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	–
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	–
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	–
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	–
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	–
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	–
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	–
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	–
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	–