Nass-Spinnen-basierte Spritzgießprozess Gelatine für die Geweberegeneration

Summary

Wir entwickelten und beschreiben ein Protokoll basiert auf dem nass Spinnerei-Konzept für den Bau von Gelatine-basierten Biomaterialien für die Anwendung des Tissue Engineering verwendet.

Abstract

Dieser Artikel stellt eine kostengünstige Methode, um Gelatine, als ein natürliches Polymer in monofilen Fasern oder andere geeignetsten Formen zu fabrizieren. Durch den nassen Methode Spinnen werden Gelatine-Fasern durch reibungslosen Extrusion in einem geeigneten Koagulation Medium produziert. Zur Erhöhung der funktionalen Oberfläche diese Gelatine-Fasern und ihre Fähigkeit, die Eigenschaften der Gewebe nachahmen kann Gelatine in eine u-Form geformt werden, mit dem Hinweis auf dieses Konzept. Von in-vitro- und in-vivo-Tests untersucht, zeigen die Gelatine-Röhren ein großes Potenzial für den Einsatz in Gewebetechnik. Handeln als geeignete Lücke Füllmaterial, Gelatine, die Rohre, das Gewebe in den beschädigten Bereich (z. B. in der nervös oder Herz-Kreislauf-System) zu ersetzen, sowie die Regeneration zu fördern, durch die Bereitstellung eines direkten Ersatz von Stammzellen und neuralen Schaltkreis verwendet werden können. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Anleitung zum Erstellen von Biomaterial basierend auf ein natürliches Polymer, und seine Umsetzung wird voraussichtlich die Entwicklung von korrelativen natürlichen Polymeren, profitieren die Gewebe Regenerationsstrategien realisieren helfen.

Introduction

Die neueste Entwicklung in der Geweberegeneration beinhaltet die Anwendung des Tissue Engineering, was eine Herausforderung für die Verbesserung der neue Therapiestrategien bei medizinischen Behandlungen darstellt. Zum Beispiel stellt das begrenzte Potential des Nervensystems Regenerierung, folgende Verletzungen oder Krankheiten, ein erhebliche gesundheitliche Problem weltweit. Aufgrund der Komplexität der pathophysiologischen Prozesse im Zusammenhang mit dem Nervensystem die Verwendung von traditionellen Spendertransplantat oder die Umsetzung der Stabilisierung Chirurgie hat gezeigt, dass Vorteile in funktionellen Ergebnisse bieten, aber es gibt keine Evidenz für die Auswirkungen von spinaler Fixierung Chirurgie^1,2. Das Gewebe an den beschädigten Bereich verloren und ersetzt mit hypertrophisch induzierte Astrozyten³, schließlich bildet einen dichten glial Narbe^4,5. Diese Matrix dient als eine Sperre, dass Blöcke die Erholung des Nervs Funktion^6,7 und ist somit erheblich behindert Regeneration. Daher geeignete Füllmaterial Lücke wird voraussichtlich verhindern den Verlust von Gewebe und reduzieren die Bildung von Bindegewebe Narbe verbunden, durch die Aufrechterhaltung der Integrität der beschädigten Bereich sowie durch Bereitstellung den direkten Ersatz von neuronalen Zellen und Schaltung, Axon Regeneration zu fördern.

Polymere Biomaterialien wurden als Gerüste für Gewebe-Regeneration-Therapie, basierend auf der Verordnung der Zelle oder Axon Verhalten und Gewebe Progression durch natürliche extrazelluläre Matrix (ECM) Unterstützung bevorzugt. Das Faser-Format gilt allgemein als ein Baustein für verschiedene Materialien, aufgrund deren eindimensionale Struktur⁸. Die Fasern erhalten Sie in der Regel durch Schmelze Extrusion oder nass Spinnerei Methode; Allerdings sind die Größe und die Kosten für die Ausrüstung und die Schwierigkeit, diese Methoden ausführen herausfordernd. Darüber hinaus hat ein Großteil der Arbeit im Zusammenhang mit Polymerfasern auf synthetische oder zusammengesetzte Materialien konzentriert. Natürliche Polymere als Quelle von Biomaterial bieten bessere Biokompatibilität Eigenschaften für den menschlichen Körper. Um die Ausrichtung des natürlichen Polymerfasern zu erhalten ist jedoch relativ schwieriger als synthetische Polymer Quellen⁹. Daher ist die Umwandlung von ein natürliches Polymer als eine reiche Quelle von Protein in Biomaterial Fasern eine wichtige Strategie — nicht nur können der Biomaterial-Fasern werden direkt isoliert vom Rohstoff, wodurch eine unnötige Transformation zu Monomeren, aber die Protein-Fasern haben auch ein gutes Aussehen und positive Eigenschaften¹⁰.

In diesem Zusammenhang beschreiben wir eine kostengünstige Verarbeitungsmethode für die Herstellung von natürlichen Polymerfasern durch das Grundkonzept der nass Spinnerei, die im Labormaßstab für das Tissue Engineering umgesetzt werden können. Nass Spinnerei erfolgt durch die Extrusion und Koagulation von einer Polymerlösung in einem geeigneten Polymers Nonsolvent. Eine geeignete, zähflüssige Lösung dotierten in Koagulation Medium bewirkt, dass die Polymermoleküle aufzulösen. Durch den Phasenübergang die Filamente dann verlieren ihre Löslichkeit und in Form von einem festen Polymers Phase¹¹ausgefällt werden. Unter Bezugnahme auf dieses Konzept, erweiterten wir dann die Entwicklung der Gelatine in die u-Form um einen Spritzgießprozess, das richtige für Gewebe-Regeneration-Anwendung gilt. Intrinsisch, darüber hinaus entwickeln wir auch jede Form von Material aus Gelatine Fasern (z. B. Gelatine Conduit aufgerollt aus mehreren Fasern, Gelatine), für andere Anwendungen gewünscht.

Gelatine, ein biologisch abbaubares natürliches Polymer aus denaturierten und hydrolysiertes Kollagen, einschließlich eines teilkristallinen, amorphen oder Dreibettzimmer spiralförmigen Bundesstaates Kollagen¹²gebildet wird. Es ist bekannt, dass Kollagen ist die wesentlichen Strukturprotein in alle Bindegewebe der Wirbeltiere und Wirbellose^13,14, die ähnlich wie die Proteinstruktur des wichtigsten ECM ist das Nervenwachstum induziert und, gleichzeitig ersetzt eine große Menge an Glykosaminoglykan abgesondert während Verletzungen des Rückenmarks. Daher wäre die Verwendung von Gelatine als Quelle eine gute Wahl für alle Fahrzeuge, medizinische. Abgesehen davon, dass eine günstige Quelle, Gelatine ist auch biologisch abbaubar und Cytocompatible und klinisch geprüft zu werden, eine vorübergehende defekt Füller¹⁵. Entwickelte sich zu einer Röhre Form, zeigen hier beschriebenen in-vitro- und in-vivo-Tests, dass Gelatine hat eine ausgezeichnete Biokompatibilität und Eignung für zukünftige Tissue engineering-Anwendungen. Kultivierten mit menschlichen Fettgewebe Stammzellen verbessern Gelatine Röhren Zelldifferenzierung in neurale Vorläuferzellen mit positiven nestin Färbung als neuronale Zelle Marker. Darüber hinaus dürfte Gelatine als Füllmaterial Lücke, wie durch die in dieser Studie etablierte Methode produziert, überschaubar und sicher sein und Gewebe Ingenieure profitieren, die derzeit korrelative natürliche Polymeren zur Verbesserung der Gewebe entwickeln Regenerationsstrategien.

Protocol

Das Fettgewebe stammen aus orthopädischen Operationen, wie von der institutionellen Review Board der Tri-Service General Hospital zertifiziert, Taipei, Taiwan, r.o.c. Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen von Animal Care Committee auf nationaler genehmigt worden Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C). 1. nass Spinnerei Prozess Vorbereitung der Lösung Lösen Sie 5 g Gelatine-Pulver in 100 mL bidestilliertem Wasser, Konzentration von 5 % (w/V) L?…

Representative Results

In dieser Studie haben wir erfolgreich die Gelatine in Fasern (Abb. 2A) und Rohre (Abbildung 2B, C) durch das benutzerfreundliche nass Spinnerei-Konzept entwickelt. Diese Gelatine-basierte Materialien können als jede medizinische Instrument, je nach ihrer Form genutzt werden. Wenn man bedenkt, dass die funktionale Oberfläche und Rahmen solcher Materialien besser geeignet für die Geweberegenera…

Discussion

Wir präsentiert die Entwicklung von Gelatine-basierten Biomaterialien mit einem einfachen nassen Drehtechnik, die in der Studie von natürlichen Polymeren für die Geweberegeneration angewendet werden können. Diese Arbeit zeigte die Möglichkeit der Herstellung von Gelatine als eine gute Proteinquelle ohne Zusatz von anderen Quellen, mit dem Ziel, die Eigenschaften der Gelatine selbst optimieren. Die Entwicklung der Gelatine-basierten Biomaterialien wurde vollständig in Raumtemperatur (22-26 ° C) durchgeführt. Eine …

Materials

Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	–
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	–
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	–
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	–
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	–
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	–
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	–
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	–
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	–
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	–