Cellule di Merkel Polyomavirus infezione e rilevamento
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per infettare primario fibroblasti cutanei umani con MCPyV. Il protocollo include isolamento dei fibroblasti cutanei, preparazione di virioni di MCPyV, l’infezione del virus, colorazione di immunofluorescenza e fluorescenza l’ibridazione in situ. Questo protocollo può essere esteso per la caratterizzazione di interazioni MCPyV-ospite e scoprire altri tipi di cellule infettabili da MCPyV.
Abstract
Merkel cella polyomavirus (MCPyV) infezione può portare a carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), una forma altamente aggressiva di cancro della pelle. Gli studi meccanicistici completamente studiare biologia molecolare MCPyV e meccanismi oncogenici sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli della coltura cellulare adeguata. Qui, descriviamo una serie di protocolli per l’esecuzione e la rilevazione dell’infezione di MCPyV delle cellule epiteliali umane primarie. I protocolli descrivono l’isolamento dei fibroblasti cutanei umani, preparazione dei virions MCPyV ricombinante e la rilevazione dell’infezione del virus di colorazione di immunofluorescenza (IF) e reazione a catena del DNA-ibridazione in situ (HCR), che è un altamente sensibile fluorescenza in situ approccio di ibridazione (pesce). I protocolli di questo documento possono essere adattati dai ricercatori interessati per identificare altri tipi di cellule o linee cellulari che supportano MCPyV infezione. L’approccio descritto di pesce può anche essere adattato per rilevare i bassi livelli di DNA virale presente nella pelle umana infetta.
Introduction
Polyomavirus delle cellule di Merkel (MCPyV) è un piccolo, double-stranded virus a DNA che è stato associato con un tumore di pelle raro ma aggressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Il tasso di mortalità di MCC, circa il 33%, superiore a quella del melanoma3,4. MCPyV ha un genoma circolare di ~ 5 kb1,5 , diviso in due da una regione regolatrice non codificanti (NCRR) in precoce e tardiva codifica regioni1. Il NCRR contiene l’origine virale della replica (Ori) e promotori di bidirezionale per trascrizione virale6,7. La regione precoce codifica proteine antigene tumore chiamati grande T (LT), piccolo T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), come pure un autoregulatory miRNA1,8,9,10. La regione tarda codifica per le proteine del capside VP1 e VP211,12,13. LT e sT sono le proteine di MCPyV meglio studiate e sono stati indicati per sostenere la replicazione del DNA virale e tumorigenesis indotto MCPyV5. Integrazione clonale di MCPyV DNA nel genoma ospite, che è stato osservato in fino a 80% di MCCs, è probabilmente un fattore causale per tumore virus-positivo sviluppo14,15.
L’incidenza di MCC è triplicato sopra i venti anni ultimi16. MCPyV l’infezione asintomatica è diffuso nella popolazione generale17,18,19. Con il crescente numero di diagnosi MCC e l’alta prevalenza dell’infezione di MCPyV, c’è la necessità di migliorare la nostra comprensione del virus e la sua potenziale oncogeno. Tuttavia, molti aspetti della biologia di MCPyV e meccanismi oncogenici rimangono capita male20. Questo è in gran parte perché MCPyV replica scarsamente cellulari stabilizzate linee11,12,21,22,23 e, fino a poco tempo, in grado di supportare MCPyV le cellule della pelle infezione non era stati individuati22. Gli studi meccanicistici per investigare completamente MCPyV e la sua interazione con cellule dell’ospite sono stati ostacolati dalla mancanza di sistema di coltura cellulare per propagare il virus5.
Abbiamo scoperto che fibroblasti cutanei umani primari (HDFs) isolato da infezione di prepuzio umano neonatale supporto robusto MCPyV entrambi in vitro ed ex vivo24. Da questo studio, abbiamo stabilito il primo modello di infezione di coltura cellulare per MCPyV24. Sulla base di questo sistema di modello, abbiamo mostrato che l’induzione di geni metalloproteasi (MMP) matrice di WNT/β-catenin signaling pathway e altri fattori di crescita stimola l’infezione MCPyV. Inoltre, abbiamo trovato che la nuova antagonista MEK approvato dalla FDA inibisce efficacemente l’infezione MCPyV5,25. Da questi studi, abbiamo anche stabilito una serie di protocolli per l’isolamento di fibroblasti cutanei umani24,25, preparando MCPyV virioni11,12, eseguendo MCPyV infezione su fibroblasti cutanei umani 24 , rilevazione MCPyV proteine di IF colorazione26e 25 . Inoltre, ci siamo adattati in situ del DNA ibridazione reazione a catena (HCR) tecnologia27 per sviluppare una tecnica altamente sensibile di pesce (pesce HCR-DNA) per la rilevazione del DNA di MCPyV in cellule epiteliali umane infettate. Questi nuovi metodi sarà utili per lo studio del ciclo infettivo di MCPyV, come pure la risposta cellulare all’infezione MCPyV. Le cellule di serbatoio ospite naturale che mantengono l’infezione MCPyV e le cellule che danno origine a tumori MCC rimangono sconosciute. Le tecniche che descriviamo in questo manoscritto potrebbero essere applicate per esaminare vari tipi di cellule umane di identificare sia le cellule del serbatoio e l’origine dei tumori MCC. I nostri metodi consolidati, come il pesce HCR-DNA, potrebbero essere impiegati anche nel rilevamento di altri virus oncogeni a DNA e la caratterizzazione delle interazioni delle cellule ospite.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi descritti sopra, compreso isolamento dei fibroblasti cutanei dal tessuto di pelle umana, la preparazione dei virions MCPyV ricombinante, infezione di cellule coltivate, macchiatura immunofluorescente e un metodo sensibile di pesce adattato dalla tecnologia HCR, che dovrebbe consentire ai ricercatori di analizzare MCPyV infezione27. Una delle fasi più critiche al raggiungimento MCPyV infezione in vitro è la produzione di preparazioni di alto-titolo virione. Utilizzando il protocollo per …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) e Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) per la fornitura di reagenti e supporto tecnico. Ringraziamo anche i membri dei nostri laboratori di discussione utile. Questo lavoro è stato supportato dalle borse di studio del National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), il NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) e il premio di Penn CFAR (P30 AI 045008).
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
References
- Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
- Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
- Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
- Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
- Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
- Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
- Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
- Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
- Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
- Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
- Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
- Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
- Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
- Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
- Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
- Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
- Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
- Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
- Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
- Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
- Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
- Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
- Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)
