Merkel-Zell-Polyomavirus Infektion und Erkennung
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären menschlichen dermalen Fibroblasten mit MCPyV zu infizieren. Das Protokoll enthält Isolation der dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von MCPyV Virionen, Virusinfektion, Immunfluoreszenz-Färbung und Fluoreszenz in Situ Hybridisierung. Dieses Protokoll kann für die Charakterisierung von MCPyV-Wirt Interaktionen und entdecken andere Zelltypen infizierbar durch MCPyV erweitert werden.
Abstract
Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) Infektion kann zum Merkel-Karzinom (MCC), eine sehr aggressive Form von Hautkrebs führen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV Molekularbiologie und onkogenen Mechanismen zu untersuchen haben durch einen Mangel an ausreichenden Zellmodelle Kultur erschwert. Hier beschreiben wir eine Reihe von Protokollen für die Durchführung und Nachweis MCPyV Infektion der primären menschlichen Hautzellen. Die Protokolle beschreiben die Isolation der menschlichen dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von rekombinanten MCPyV Virionen und Nachweis von Virus-Infektion durch immunofluorescent (IF) Färbung und in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR), die sehr empfindlich ist Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Ansatz. Die Protokolle hierin können angepasst werden, indem interessierte Forscher identifizieren, andere Zelltypen oder Zell-Linien, die MCPyV Infektion unterstützen. Die beschriebene Vorgehensweise der Fisch könnte auch zur Erkennung von niedrigen Niveau der viralen DNA in die infizierten menschlichen Haut angepasst werden.
Introduction
Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) ist eine kleine, doppelsträngige DNA-Virus, das eine seltene, aber aggressiver Hautkrebs, Merkel Cell Carcinoma (MCC)1,2zugeordnet wurde. Die Sterblichkeit von MCC, rund 33 % übersteigt die der Melanom-3,–4. MCPyV hat eine kreisförmige Genom von ~ 5 kb1,5 geteilt durch eine nicht-kodierenden regulatorischen Region (NCRR) in frühen und späten Codierung Regionen1. Die NCRR enthält die viralen Ursprungs der Replikation (Ori) und bidirektionale Promotoren für virale Transkription6,7. Die frühen Region kodiert Tumor Antigen Proteine genannt großen T (LT), kleine T (sT), 57kT, alternative LT ORF (alt) sowie ein Autoregulatory MiRNA1,8,9,10. Die späten Region kodiert das Kapsid Proteine VP1 und VP211,12,13. LT und sT sind die am besten untersuchten MCPyV Proteine und haben gezeigt, dass die virale DNA-Replikation und MCPyV-induzierten Tumorgenese5unterstützen. Klonale Integration der MCPyV DNA in das Wirtsgenom, die in bis zu 80 % der MCCs beobachtet wurde, ist wahrscheinlich ein ursächlicher Faktor für Virus-positiven Tumor Entwicklung14,15.
Die Inzidenz von MCC hat in den vergangenen zwanzig Jahren16verdreifacht. Asymptomatische MCPyV Infektion ist auch weit verbreitet in der allgemeinen Bevölkerung17,18,19. Mit der zunehmenden Zahl von MCC Diagnosen und die hohe Prävalenz von MCPyV Infektion ist für unser Verständnis des Virus und seine onkogenen Potential zu verbessern. Jedoch bleiben viele Aspekte der MCPyV Biologie und onkogenen Mechanismen schlecht verstandene20. Dies ist vor allem, weil MCPyV repliziert schlecht in etablierten Zelle Linien11,12,21,22,23 und bis vor kurzem Hautzellen unterstützen MCPyV Infektion nicht entdeckten22gewesen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV und seine Wechselwirkung mit Wirtszellen zu untersuchen haben durch einen Mangel an Zellkultursystem für die Vermehrung des Virus5behindert.
Wir entdeckten, dass primäre menschliche dermale Fibroblasten (HDFs) von Neugeborenen menschliche Vorhaut Unterstützung robuste MCPyV Infektion sowohl in-vitro isoliert- und ex-Vivo–24. Aus dieser Studie haben wir die erste Zelle Kultur Infektionsmodell für MCPyV24. Aufbauend auf diesem Modellsystem, haben wir gezeigt, dass die Induktion von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Gene durch den WNT/β-Catenin Signalisierung Weg und andere Wachstumsfaktoren MCPyV Infektion stimuliert. Darüber hinaus fanden wir, dass die FDA-zugelassenen MEK Antagonist Trametinib effektiv MCPyV Infektion5,25hemmt. Aus diesen Studien haben wir auch eine Reihe von Protokollen für die Isolierung von menschlichen dermalen Fibroblasten24,25, MCPyV Virionen11,12, vorbereiten, durchführen von MCPyV Infektion auf menschlichen dermalen Fibroblasten 24 , 25 und Erkennung von MCPyV Proteine durch IF Färbung26. Darüber hinaus haben wir die in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR) Technologie27 eine hochempfindliche Fisch-Technik (HCR-DNA Fisch) entwickelt zur Erfassung von MCPyV DNA in infizierten menschlichen Hautzellen angepasst. Diese neuen Methoden werden für das Studium des ansteckenden Zyklus der MCPyV als auch die zelluläre Reaktion auf eine MCPyV Infektion nützlich sein. Das natürliche Reservoir Wirtszellen, die MCPyV Infektion beibehalten und die Zellen, die Anlass zu MCC Tumoren bleiben unbekannt. Die Techniken, die wir in dieser Handschrift beschreiben könnte angewendet werden, um verschiedene Arten von menschlichen Zellen, sowohl die Reservoir-Zellen zu identifizieren und Herkunft der MCC Tumoren zu untersuchen. Unsere etablierten Methoden wie HCR-DNA Fisch, konnte auch in der Erkennung von anderen DNA-Tumorviren und Charakterisierung von Host-Zell-Interaktionen eingesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methoden, die oben beschrieben, inklusive Isolation der dermalen Fibroblasten aus menschlicher Hautgewebe, Vorbereitung der rekombinanten MCPyV Virionen, Infektion des kultivierten Zellen, immunofluorescent Färbung und eine empfindliche Fische Methode adaptiert von HCR-Technologie, die sollten Forscher MCPyV Infektion27analysieren können. Einer der kritischsten Schritte zur Erreichung MCPyV Infektion in-vitro-ist die Herstellung von hoch-Titer Virion Zubereitungen. Unter Verwendung des Proto…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institut) und Dr. M. Celeste Simon (Universität von Pennsylvania) Danke für die Reagenzien und technische Unterstützung. Wir danken auch die Mitgliedern unserer Labore für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) Stipendien (R01CA187718, R01CA148768 und R01CA142723), das NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) und dem Penn CFAR Award (P30 AI 045008) unterstützt.
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
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