הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב
Summary
כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של התקנה ניסיונית עבור ניתוח של ההערכה של שלמות ה-DNA בתאי גזע לפני השתלת תא.
Abstract
גזע ותאי גזע-תא-derived יש פוטנציאל עצום כטיפול משובי למחלות ניווניות שונות. DNA למחסן של נתונים גנטיים בתאים כל, לרבות תאי גזע, והיא ושלמותה הוא היסוד הרגנרציה שלו. תאי גזע עוברים התפשטות מהירה במעבדות כדי להשיג את המספרים הדרושים עבור השתלת. גדילת התאים מואצת מוביל אובדן שלמות הדנ א על ידי מטבוליטים שהצטברו, כגון חמצן תגובתי, קרבוניל קטלניים. משתילים תאים אלה היו מסתיימים engraftment המסכן והתחדשות של האיבר המידרדר. יתר על כן, משתילים הפניות תאים פגומים-DNA מוטציות, יציבות של ה-DNA, הזדקנות ביולוגית הסלולר, כנראה, סכנת מחלות כמו סרטן. לכן, יש צורך מיידי שיטה בקרת איכות להעריך את התאמתם של התא השתלת. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד ההערכה של שלמות הדנ א של תאי גזע לפני השתלת תא.
Introduction
הוכחה ניסויית וקלינית מדגים כי השתלת תא בינוני עשוי לשפר את ביצועי כויץ של החדר השמאלי של כשל לבבות1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. ההתקדמות האחרונה נפתחו עוד יותר מושך הזדמנויות עבור התחדשות לב וכלי דם; אלה כוללים את הביטוי כפויה של גורמים התיכנות בתאים סומטיים כדי לגרום pluripotency, להבדיל אלה בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) לתוך הלב שושלות שונות, חשוב cardiomyocyte (ס מ)10, 11 , 12 , 13. החומר התורשתי בכל תא, כולל iPSCs שנוצר באופן מלאכותי, נגזר iPSC ס”מ (iPS-ס”מ), הוא ה-DNA. ההוראות הגנטי האצור ב- DNA מכתיב את הצמיחה, ופיתוח פונקציה של תאים, רקמות, איברים אורגניזמים. הדנ א אינה אינרטי; תא מטבוליטים, כגון חמצן תגובתי, קרבוניל חנקן מינים, ונזק קטלניים יכול לגרום DNA במבחנה, ויוו14,15,16,17. חשוב לציין, נזק לדנ א מתרחשת באופן אינטואיטיבי בכל תא, עם תדירות משמעותית. אם נזקים אלה לא מתוקנות, זה יוביל מוטציית דנ א, הזדקנות ביולוגית הסלולר, האובדן של ה-DNA של תאים שלמות, ואולי, מחלות, כולל סרטן סכנת חיים. לכן, שמירה על שלמות הדנ א הוא חיוני תא כלשהו, במיוחד iPSCs, בעל פוטנציאל עצום במרפאה.
להערכת את הכמות ואת היושרה של דנ א גנומי מבודד, ציוד יקר זמין על השוק. עם זאת, קיימות שיטות לא פשוטים וחסכוניים כדי להעריך את תקינות ה-DNA בתאים ללא בידוד התאים. יתר על כן, המשתמש-induced השפלה DNA במהלך בידוד ה-DNA הוא אחד החסרונות הגדולים בעוד בשיטות אלה. תא בודד ג’ל אלקטרופורזה (המכונה שביט assay)18,19 , γH2A.X immunolabeling8 הטכניקות הן גישות יסוד במעבדות מחקר להערכת נזק לדנ א. שתי שיטות אלו אינם דורשים ציוד יקר או מבודד הדנ א כדי לנתח DNA שלמות8,20,21. . מאז, טכניקות אלה בוצעו עם תאים שלמים; משתמש-induced השפלה DNA/RNA/חלבון במהלך הכנת המדגם לא ישפיעו על פרוטוקולים אלה. . כאן, כדי להעריך נזק לדנ א של DNA נזק תגובת גזע ותאי גזע-תא-נגזר, אנו מספקים פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי לבצע שני את כוכב השביט assay, γH2A.X immunolabeling. יתר על כן, שילוב שתי הגישות האלה, אנו מציעים הערכה תמים יכול לשמש כדי להעריך את התאמתם של התא השתלת.
כוכב השביט assay, או תא בודד ג’ל אלקטרופורזה, מודד את מעברי DNA בתאים. תאים בתוך התכה נמוכה agarose הם lysed כדי nucleoids טופס המכיל supercoiled DNA. על אלקטרופורזה, חתיכות קטנות של DNA מפוצלים ו גדילי DNA שבור נודדים דרך הנקבוביות agarose, ואילו ה-DNA ללא פגע, בשל גודלם העצום שלהם ההטיה עם החלבון מטריקס, תהיה העברה מוגבלת. תבנית ה-DNA מוכתם תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות מחקה כוכב שביט. בראש שביט מכיל דנ א ללא פגע, הזנב הוא מורכב שברים ושבר גדילי ה-DNA. השבר של נזק לדנ א נמדד על ידי קרינה פלואורסצנטית האינטנסיביות של הדנ א פגום (זנב השביט) יחסית העוצמה (ראש שביט) ה-DNA ללא פגע. לרגע הפרמטר הזנב ניתן לחשב כמוצג באיור1.
נזק לדנ א גורם זירחון של היסטון H2A. X (γH2A.X) בשעה Ser139 על-ידי kinases כספומט, ATR ו- DNA-PK. זרחון והגיוס של H2A. X-מעברי גדיל DNA נקרא DNA נזק התגובה (DDR) והוא קורה במהירות לאחר הדנ א פגום. בעקבות תהליך זה, בתיווך מחסום מחזור התא מעצר DNA מבוצעים תהליכים לתיקון. לאחר סיום מוצלח של תיקון ה-DNA, γH2A.X dephosphorylated, מומת על ידי phosphatases. ממושך, מספר מעברי גדיל DNA לגרום להצטברות של γH2A.X מוקדים ב- DNA. הדבר מעיד על חוסר היכולת של התא כדי לתקן את הנזק DNA ואובדן של שלמות הדנ א. מוקדים אלה γH2A.X בדנ א יכול להיות מזוהה על ידי, מספר מוקדים DDR ניתן לספור באמצעות הפרוטוקול בסעיף 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלמות הדנ א מציגה שלמות התא. תאים עם דנ”א פגום הם לעתים קרובות בלחץ, בסופו של דבר מאבד את היושר שלהם. השלמות של גזע, תאי גזע-תא-נגזר להיות מופצים לצורך השתלת הוא עיקרי עבור התאים לביצוע תפקידם הרצוי. משתילים תאים עם דנ”א פגום יגרום קצב engraftment המסכן ובביצועים של8,תא20…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי הלאומי ללב, ריאות, דם המכון מענקים RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 ו UO1-HL-134764 (כדי ג’יי ג’אנג) ועל -ידי האמריקאי הלב איגוד מדעי מענק פיתוח 17SDG33670677 (ל Kannappan ר).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
