Summary

Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

Published: February 05, 2019
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Summary

Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni in acido deossiribonucleico (DNA). Questo protocollo viene descritto come eseguire la mutagenesi sito-diretta con un passaggio 2 e 3-passo catena della polimerasi (PCR) base di approccio, che è applicabile a qualsiasi frammento di DNA di interesse.

Abstract

Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni nel DNA per studiare l’interazione tra piccole molecole di acido ribonucleico (sRNA) di non-codificazione e destinazione RNA messaggeri (mRNA). Inoltre, mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per mappare i siti di legame della proteina specifica a RNA. Una 2-step e step 3 Introduzione PCR basata delle mutazioni è descritto. L’approccio è rilevante per tutte le proteine-RNA e studi di interazione di RNA-RNA. In breve, la tecnica si basa sulla progettazione degli iniettori con la mutazione desiderata e attraverso 2 o 3 passaggi di PCR sintetizzando un prodotto PCR con la mutazione. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato per la clonazione. Qui, descriviamo come eseguire mutagenesi sito-diretta con entrambi l’approccio 2 – e 3-step per introdurre mutazioni il sRNA, McaS e il mRNA, csgD, per studiare le interazioni RNA-proteine e RNA-RNA. Applichiamo questa tecnica per studiare le interazioni RNA; Tuttavia, la tecnica è applicabile a tutti gli studi di mutagenesi (ad es., interazioni della DNA-proteina, amminoacido sostituzione/eliminazione/aggiunta). È possibile introdurre qualsiasi tipo di mutazione tranne per basi non naturali, ma la tecnica è applicabile solo se un prodotto PCR può essere usato per applicazione a valle (ad es., clonazione e modello per ulteriore PCR).

Introduction

DNA è spesso definito come il progetto di una cellula vivente, poiché tutte le strutture della cellula sono codificate nella sequenza del suo DNA. Replica esatta e meccanismi di riparazione del DNA garantiscono che solo molto bassi tassi di mutazioni si verificano, che è essenziale per sostenere le funzioni corrette dei geni codificati. Modifiche della sequenza del DNA possono influire sulle successive funzioni a diversi livelli a partire con il DNA (riconoscimento di fattori di trascrizione e gli enzimi di limitazione), poi RNA (base-accoppiamenti complementarità e alterazioni di struttura secondaria) e/o proteine (aminoacidi acide sostituzioni, omissioni, aggiunte o telaio-turni). Mentre molte mutazioni non influiscano significativamente funzione del gene, alcune mutazioni nel DNA possono avere implicazioni enormi. Così, la mutagenesi sito-diretta è uno strumento prezioso per studiare l’importanza dei siti specifici di DNA a tutti i livelli.

Questo protocollo descrive un approccio di mutagenesi mirata utilizzato per introdurre mutazioni specifiche. Il protocollo si basa su due diverse strategie di PCR: un passaggio 2 o un 3-passo PCR. La PCR 2-step è applicabile se la mutazione desiderata è vicino l’estremità 5′ o estremità 3′ del DNA di interesse (< 200 paia di basi (bp) dalla fine) e la PCR-step 3 è applicabile in tutti i casi.

L’approccio di PCR 2-step, 3 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 3, avanti e indietro, rispettivamente) e un singolo primer è progettato per incorporare la mutazione. La mutazione introducendo primer (primer 2) dovrebbe avere un orientamento inverso se la mutazione è vicino l’estremità 5′ e un orientamento anteriore se la mutazione è vicino all’estremità 3′. Nel primo passaggio PCR, primer 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un piccolo frammento vicino l’estremità 5′ o 3′ estremità, rispettivamente. Il prodotto PCR risultante viene quindi utilizzato come primer nel passaggio due con primer 1 o 3, con il risultato di un prodotto PCR con una mutazione nel DNA di interesse (Figura 1A).

Nella PCR 3 fasi, 4 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 4, avanti e indietro, rispettivamente) e un set di primer è progettato per incorporare specifiche mutazioni con sovrapposizione di complementarità (primer, 2 e 3, invertire e inoltrare, rispettivamente). Al passo uno e due, primer 1 + 2 e 3 + 4 amplificare l’estremità 5′ e 3′. Nel passaggio 3, i prodotti PCR ottenuti da passo uno e due sono utilizzati come modelli e amplificati con i primer 1 + 4. Così, il prodotto PCR risultante è il DNA di interesse con la mutazione desiderata (Figura 1B).

Mentre il DNA mutato può essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle, questo protocollo viene descritto come combinare nuovamente il DNA in un vettore di clonazione. L’uso di vettori di clonazione ha diversi vantaggi come la facilità di clonazione e applicazioni sperimentali specifiche a seconda delle caratteristiche del vettore. Questa caratteristica viene spesso utilizzata per studi di interazione di RNA. Un’altra tecnica per studi di interazione di RNA è strutturale di sondaggio del RNA in complesso con un altro RNA1,2 o proteina3,4. Tuttavia, sondando strutturale viene eseguita solo in vitro mentre mutagenesi sito-diretta e successiva clonazione permettono per studi di interazione in vivo.

Mutagenesi sito-diretta è stato ampiamente utilizzata per studi di interazione di RNA come presentato qui. Tuttavia, il metodo chiave per quanto riguarda 2 – o 3-step PCR è applicabile a qualsiasi pezzo di DNA e così non solo limitato agli studi di RNA-interazione.

Per esemplificare la tecnica e i suoi possibili usi, caratterizzazione delle regioni importanti per la regolazione post-trascrizionale del mRNA, csgD, di Escherichia coli (Escherichia coli) è usato. In e. coli, csgD è mirato di piccolo RNA non codificanti, McaS, in collaborazione con una proteina, Hfq, di reprimere l’espressione della proteina di CsgD2,4,5. La tecnica è utilizzata per introdurre le mutazioni nella regione di appaiamento tra csgD e McaS e per il sito di legame Hfq di CDLS. Il DNA ottenuto è quindi clonato in un vettore adatto per esperimenti successivi. Applicazioni a valle della tecnica includono gli esperimenti sia in vitro che in vivo. Per l’illustrazione, esempio 1 è caratterizzata in vivo usando un’analisi di western blot ed esempio 2 è caratterizzato in vitro utilizzando un’analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA). In entrambi i casi, è illustrata come mutagenesi sito-può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche per rendere biologici conclusioni circa un gene di interesse.

Protocol

1. selezione vettoriale Scegliere un vettore per eseguire esperimenti a valle con. Ogni vettore è applicabile per questo metodo PCR 2 – e 3-step. Sulla scelta del vettore di base, scegliere enzimi di restrizione appropriati per la clonazione. 2. primer design per sito diretto mutagenesi Decidere tra la strategia PCR 2-passaggio o 3 (2-step è solo per le mutazioni < 200 bp da entrambe le estremità del DNA di interesse). Per la PCR 2-step, andare al passagg…

Representative Results

Per indagare le interazioni RNA per quanto riguarda la regolazione post-trascrizionale di CDLS, è stata scelta una configurazione doppia vettoriale: uno per esprimere la csgD mRNA e un altro per esprimere il piccolo RNA non codificante, McaS. CDLS è stato clonato in pBAD33, che è un plasmide di medio-copia inducibile di arabinosio con resistenza al cloramfenicolo e McaS è stato clonato in mini pNDM220 R1, che è un plasmide di viscoelastica copia basso isopr…

Discussion

Mutagenesi sito-diretta ha una vasta gamma di applicazioni diverse, e qui, risultati rappresentativi da un esperimento in vitro ed una in vivo sono stati inclusi come esempi di come fare conclusioni biologici usando la tecnica. Mutagenesi sito-diretta ha per lungo tempo lo standard d’oro per gli studi di interazione di RNA. La forza della tecnica risiede nella combinazione di introdurre rilevanti mutazioni con dosaggi a valle ed esperimenti (ad es., macchia occidentale o EMSA) per trarre conclusioni sui siti specifici de…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrei ringraziare borse di studio di Università della Danimarca meridionale accesso aperto politica.

Materials

Anti-GroEL antibody produced in rabbit Merck G6532 Primary antibody
Azure c200 Azure NA Gel imaging workstation
Custom DNA oligo Merck VC00021
DeNovix DS-11 DeNovix NA Spectrophotometer for nucleic acid measurements
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Scientific R0611
Ethidium bromide solution 1 % Carl Roth 2218.1
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix Fermentas SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi Gerard Biotech TO12 Dialysis tubes for electro elution
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell Bio-Rad 1704406 Horizontal electrophoresis system
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Merck F3165 Primary antibody
Mouse Immunoglobulins Dako Cytomation P0447 HRP conjucated secondary antibody
NucleoSpin miRNA Macherey Nagel 740971 RNA purification
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Scientific NP0323BOX Bis-Tris gels for protein separation
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S DNA polymerase
PowerPac HC High-Current Power Supply Bio-Rad 1645052
Rabbit Immunoglobulins Dako Cytomation P0448 HRP conjucated secondary antibody
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
SigmaPlot Systat Software Inc NA Graph and data analysis software tool
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096 PCR machine
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Ligase
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201S
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) Thermo Scientific B49

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Citer Cet Article
Andreassen, P. R., Pettersen, J. S., Jørgensen, M. Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (144), e58996, doi:10.3791/58996 (2019).

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