Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode um eine Nanoemulsion eine Ölsäure acids-platinum(II) Konjugat mit einer Lysin-Tyrosin-Phenylalanin (KYF) Tripeptid stabilisiert zu synthetisieren. Die Nanoemulsion Formen unter milden synthetischen Bedingungen über Self-assembly von der KYF und das Konjugat.

Abstract

Wir beschreiben eine Methode um eine Nanoemulsion bestehend aus einem Ölsäure acids-Pt(II) Kern und einer Lysin-Tyrosin-Phenylalanin (KYF) Beschichtung (KYF-Pt-NE) zu produzieren. KYF-Pt-NE Pt(II) bei 10 Gew.-% kapselt, hat einen Durchmesser von 107 ± 27 nm und eine negative Oberflächenladung. KYF-Pt-NE ist stabil im Wasser und im Serum und ist biologisch aktiv. Die Konjugation der Fluorophor, KYF ermöglicht die Synthese von einem fluoreszierenden Nanoemulsion die für biologische Bildgebung geeignet sind. Die Synthese von der Nanoemulsion wird in einer wässrigen Umgebung und die KYF-Pt-NE Formen über Self-assembly eine kurze KYF-Peptid und ein Konjugat Ölsäure acids-platinum(II) durchgeführt. Die Selbstmontage Prozess hängt die Temperatur der Lösung, das molare Verhältnis der Substrate und der Durchflussmenge des Substrats hinaus. Entscheidende Schritte umfassen Beibehaltung der optimalen rühren Rate während der Synthesis, genügend Zeit für die Selbstmontage bei schönem und Pre-Konzentration der Nanoemulsion allmählich in eine zentrifugale Konzentrator.

Introduction

In den letzten Jahren gab es ein wachsendes Interesse an der Technik von Nanopartikeln für biomedizinische Anwendungen wie Drug Delivery und Bioimaging^1,2,3,4. Die Multifunktionalität von Nanopartikel-basierten Systemen erfordert oft unter Einbeziehung mehrerer Komponenten innerhalb einer Formulierung. Die Bausteine, die oft auf Lipide oder Polymeren basieren unterscheiden sich hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften sowie ihrer Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit, was letztlich die Funktion der Nanostruktur^1, beeinträchtigt ^5,6. Biologisch abgeleitete Materialien, wie Proteine und Peptide, wurden lange als viel versprechende Komponenten von multifunktionalen Nanostrukturen aufgrund ihrer Sequenz Flexibilität^7,8anerkannt. Peptide, die selbst-zusammenbauen in hochgeordnete supramolekularen Architekturen bilden spiralförmige Bänder^9,10, faserigen Gerüste^11,12und viele mehr, und ebnete damit den Weg zu Haus Biomolekül-basierten Hybrid Nanostrukturen mit einem Bottom-up-Ansatz¹³.

Peptide wurden für Anwendungen in Medizin und Biotechnologie, vor allem für die Krebstherapie¹⁴ und Herz-Kreislauf-Krankheiten¹⁵ sowie für antibiotische Entwicklung^16,17, metabolische untersucht Störungen¹⁸und Infektionen¹⁹. Es gibt über hundert kleinen Peptid-Therapeutika, die in klinischen Studien²⁰. Peptide sind einfach zu ändern und schnell, kostengünstig zu synthetisieren. Darüber hinaus sind sie biologisch abbaubar, das erleichtert ihre biologische und pharmazeutische Anwendungen^21,22. Die Verwendung von Peptiden als strukturelle Komponenten umfasst das Engineering von responsive, Peptid-basierte Nanopartikel und Hydrogel Depots für kontrollierte Freisetzung^{23,24,25,26 , 27}, Peptid-basierte Biosensoren^28,29,30,31, oder Bio-elektronische Geräte^32,33,34. Wichtig ist, fanden sich auch kurze Peptide mit zwei oder drei Aminosäure-Resten, die Phenylalanin enthalten, führen die Selbstmontage^35,36,37 verarbeitet und stabilisierte Emulsionen^{38 zu schaffen} .

Platin-basierte Medikamente, aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit in vielen Krebs-Behandlungsschemata, sowohl allein als auch in Kombination mit anderen Agenten^39,40eingesetzt. Platin Verbindungen verursachen DNA-Schäden durch die Bildung von Interstrand, Monoadducts bzw. Intrastrand Querverbindungen. Die Pt-DNA-Läsionen sind durch die zelluläre Maschinerie erkannt und wenn nicht repariert, zu zellulären Apoptose führen. Der wichtigste Mechanismus, den PT(II) zum Krebs Zelltod beiträgt ist die Hemmung der DNA-Transkription^41,42. Allerdings sind die Vorteile von Platin-Therapie durch systemische Toxizität des Pt(II) verringert, die schweren Nebenwirkungen auslöst. Dies führt zu niedrigeren klinische Dosierung von Pt(II)⁴³, führt oft zu Sub-therapeutische Konzentrationen von Platin erreichen die DNA. Infolgedessen trägt die DNA-Reparatur, die folgt, Krebs Zelle überleben und den Erwerb von Pt(II) Widerstand. Die Platin Chemo-Widerstand ist ein großes Problem in der Anti-Krebs-Therapie und die Hauptursache für Behandlung Scheitern^44,45.

Wir haben eine stabile Nanosysteme entwickelt, die den Pt(II)-Agent um eine Schirmwirkung im systemischen Kreislauf versorgen und die Pt II-induzierten Nebenwirkungen zu vermindern kapselt. Das System basiert auf einem Ölsäure acids-Pt(II) Kern mit einem KYF Tripeptid bilden eine Nanoemulsion (KYF-Pt-NE)⁴⁶stabilisiert. Die Bausteine der KYF-Pt-NE, die Aminosäuren der Tripeptid sowie die Ölsäure, haben den Status im allgemeinen erkannt als Safe (GRAS) mit Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE wird mithilfe einer Nanoprecipitation Methode⁴⁷vorbereitet. Kurz gesagt, wird die Ölsäure acids-Pt(II) Konjugat in einem organischen Lösungsmittel gelöst und dann tropfenweise zu einer wässrigen Lösung KYF (Abbildung 1) bei 37 ° C. Die Lösung wird für mehrere Stunden in Selbstmontage KYF-Pt-ne erlauben gerührt. Die Nanoemulsion wird in 10 kDa zentrifugale Konzentratoren konzentriert und dreimal mit Wasser gewaschen. Die chemische Modifizierung von KYF mit einem Fluorophor ermöglicht die Synthese von fluoreszierenden FITC-KYF-Pt-NE für biomedizinische Bildgebung geeignet.

Protocol

1. Synthese von Ölsäure Acids–Platinum(II) Konjugat Aktivierung von cisplatin Aussetzen von 50 mg (0.167 Mmol) von Cisplatin in 4 mL Wasser (z.B. Nanopure) bei 60 ° C. Die Lösung von Cisplatin tropfenweise 55,2 mg (0.325 Mmol) AgNO3 in 0,5 mL Wasser hinzu und rühren Sie die Reaktion für mindestens 2 h bei 60 ° C. Zeigt den Fortschritt der Reaktion bilden der weiße Niederschlag von AgCl. Um festzustellen, ob die Aktivierung Reaktion abgeschlossen ist, führen Si…

Representative Results

Vertreter TEM Bild von KYF-Pt-NE unter Verwendung dieses Protokolls ist in Abbildung 2Adargestellt. KYF-Pt-NEs sind sphärische Morphologie, gut verteilt, und einheitlich in der Größe. Der Kerndurchmesser des KYF-Pt-NEs, gemessen direkt von drei TEM Bilder mit einem Minimum von 200 Messungen durchgeführt, ist 107 ± 27 nm. Die hydrodynamische Durchmesser von KYF-Pt-NE, mit dynamischen Licht Spektroskopie (DLS), analysiert erwies sich 240 nm mit einem Polyd…

Discussion

Wichtige Schritte bei der Nanoemulsion Synthese gehören das molare Verhältnis der Substrate anpassen, Erhaltung Temperatur und Durchflussmenge Tarifsteuerung während Ölsäure acids–Pt(II) Zugabe und ausreichend Zeit für die Selbstmontage und Reinigung das Produkt mit einer zentrifugale Konzentrator Spalte. Diese Parameter beeinflussen die Größe und Morphologie der KYF-Pt-NE; Daher ist es besonders wichtig, das richtige molare Verhältnis pflegen und die synthetischen Bedingungen korrekt einstellen.

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Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU)	ANASPEC INC.:	AS-20376	SPPS
4-well chamber confocal dish	Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific	154526	For imaging
6-bromohexanoic acid	Chem-Impex INT’L INC.	24477	Click modification for peptide
A2780	Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital		Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure	Thermo Fisher	D11901	water filtration system
BUCHI rotavapor R-3	Buchi	Z568090	For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R	eppendorf	5811F	For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99%	Acros Organics	19376-0050	in vitro tests
CP70	Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital		Ovarian cancer cell line
Digital water bath	VWR	97025-134	For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS)	Brookhaven Instrument Corporation		For nanoparticle size measurments
ES-2	ATCC	CRL-1978	ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79%	Chem-Impex INT’L INC.	00493	SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g),	Chem-Impex INT’L INC.	01914	SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%	Alfa Aesar	H59730	SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator	Thermo Scientific Fisher		incubator
High pressure syringe pump	New Era	1010-US	For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer	VWR	12365-382	For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647)	Santa Cruz Biotechnology	sc-18821 AF647	For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)	Oakwood Chemical	005027	SPPS
Ninhydrin 99%	Alfa Aesar	A10409	Kaiser test
Oleic acid	Chem-Impex INT’L INC.	01421	For platinum complex synthesis
OV90	ATCC	CRL-11732	Ovarian cancer cell line
PBS	Corning	21-031-CV	For cell wash
Permount mounting medium	Fisher Chemical	SP15-100	For imaging
Phenol	Fisher Chemical	A92500	Kaiser test
Phosphotungstic acid	Fisher Chemical	A248-25	negative stain for TEM
Piperidine 99%	BTC	219260-2.5L	SPPS
Platinum AAS standard soultion	Alfa Aesar	88086	1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97%	Alfa Aesar	L10595	For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet	Thermo Scientific Fisher	1385	Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System	Welch	2028	Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate	Acros Organics	19768-0250	Cisplatin activation
SKOV3	ATCC	HTB-77	Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S313-1	For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride	Sigma Aldrich	208256	Test for Platinum presence
TOV21G	ATCC	CRL-11730	Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA)	Alfa Aesar	L06374	SPPS
Triisopropylsilane (TIPS)	Chem-Impex INT’L INC.	01966	SPPS
Triton-X	Sigma Aldrich	T8787-100ML	For imaging
Uranine powder 40%	Fisher Scientific	S25328A	For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO)	Sartorious	VS2001	For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope	VWR	89404-462	For cell culture monitoring